深部熱療對AD離體細胞治療模式的探索及療效

陳劍虹 王小璞 農海寧 鮑 晉 盧宜民

廣州中醫藥大學祈福醫院, 廣東 廣州 511495

深部熱療對AD離體細胞治療模式的探索及療效

陳劍虹 王小璞 農海寧 鮑 晉 盧宜民*

廣州中醫藥大學祈福醫院, 廣東 廣州 511495

目的：探索深部熱療對AD離體細胞的最佳治療模式并評估治療效果。方法：制備離體AD細胞模型，隨機分成對照組、對照組熱療組、AD模型組、AD模型熱療組，分別置于41.5℃加熱30、45、60、75、90min，于600nm處測吸光度(A)值，計算最佳熱療時間。造模成AD細胞后置于41.5℃加熱60min，加熱后繼續置于37℃恒溫孵育24h，分別于加熱后2、4、8、12、24、72h取出，使用流式細胞儀行活細胞膜HSP70表達量，計算最佳熱療間隔時間。4組細胞熱療后分別加入20μmol/L的Aβ25-35溶液培養24h，應用流式細胞儀檢測細胞活力，評估熱療治療AD效果。結果：對照組和AD模型組分別給予不同時間41.5℃熱療，兩組細胞從加熱60min開始細胞增殖趨勢與非加熱細胞相比開始下降(P<0.05)，這種下降趨勢在75min達到最大，確定細胞加熱的安全有效時間為60min，同時對照熱療組與AD模型熱療組對比，兩組細胞隨溫度變化的細胞增殖趨勢基本相同，兩者比較無統計學差異(P>0.05)，表明兩組細胞的最佳熱療時間均為60min。AD模型組細胞在熱療后2、4、8、12、24及72h各時間段監測的HSP70表達量均不同，AD細胞在24hHSP70表達量均達到最大值(P<0.05)，其后HSP70表達量開始下降，表明24h是最佳的熱療間隔時間。4組細胞與Aβ作用后加熱，MTT檢測表明4組細胞活力呈溫度依賴性上升趨勢(P<0.05)，表明熱療可有效的減少Aβ的聚集，促進Aβ的清除，保護AD細胞。結論：深部熱療對AD離體細胞的最佳熱療時間為60min，最佳熱療間隔時間為24h，深部熱療可以有效的清除Aβ，促進神經元細胞修復。

深部熱療; AD; 離體細胞; 治療模式

阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)，是一種中樞神經系統變性病，起病隱匿，以進行性記憶力障礙、認知障礙和精神異常為主要臨床特征的一種老年癡呆性疾病[1]。AD病理特征是神經元細胞外液β蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積形成神經炎性斑，神經元內神經纖維沉結以及海馬皮層區域神經元的大量丟失[2]。近年來大量研究發現，AD患者顱腦內神經元中熱休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)表達較正常人明顯減少。神經元細胞在加熱或其他損傷性刺激時會產生保護性的HSP，其中HSP70是中樞神經系統含量最豐富的HSP，其具有抑制Aβ聚集，從而保護神經元的作用[3]。本實驗通過給P12神經細胞株注射Aβ25-35建立AD細胞模型，觀察不同熱療時間，不同熱療間隔期對AD細胞的活性及HSP70的表達，探索深部熱療對AD細胞的最佳治療模式并評估治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 Aβ25-35、二甲基亞礬(DMSO)和四甲基偶氮唑鹽(MTT)均為美國Sigma公司產品；其余均為國產分析純試劑。儀器：倒置相差顯微鏡由日本Olympus公司購進；恒溫CO2培養箱為美國Thermo公司；FACSCalibur流式細胞儀由美國BectonDicknson公司購進；多功能酶標儀由德國BMG公司購進。

1.2 試驗方法

1.2.1 觀察在離體細胞水平 觀察熱療后HSP70的表達，摸索安全的熱療加熱時間及最佳的熱療間隔時間。

1.2.1.1 制備離體AD細胞模型 給予20μmol/L Aβ25-35孵育神經細胞株P12細胞(由暨南大學提供)培養24h。

1.2.1.2 選擇合適的熱療時間 取對數生長期P12細胞，以1×104個細胞，100uL/孔接種于96孔培養板，繼續于孵育箱中培養24h，隨機分成對照組、對照組熱療組、AD模型組、AD模型熱療組，分別置于41.5℃加熱30、45、60、75、90min，每個時間點各組設5個復孔，實驗結束后，每孔加5mg/mL MTT0.015mL，置CO2培養箱內培養4h，棄上清，每孔加0.15mL DMSO，充分震蕩后，于600nm處測吸光度(A)值。

1.2.1.3 選擇合適的熱療間隔時間 熱效應存在熱耐受性，現根據HSP70的表達量變化明確最佳熱療間隔時間。取對數生長期P12細胞，以1×104個細胞，100ul/孔接種于96孔培養板，繼續于孵育箱中培養24h，造模成AD細胞后置于41.5℃加熱Xmin(根據1.2.1.2摸索出的時間)，加熱后繼續置于37℃恒溫孵育24h，分別于加熱后2、4、8、12、24、72h取出，加熒光標記的抗HSP70mAb，使用流式細胞儀行活細胞膜HSP70表達量，根據HSP70表達量的變化趨勢避開AD細胞的熱耐受期，選擇最佳的熱療間隔時間(Y h)。

1.2.2 標準熱療后離體細胞水平下觀察各組細胞的細胞活力 進一步研究熱療在治療AD中的可能作用。①隨機分成4組，分別為P12對照組、P12對照組+熱療組(熱療Xmin，間隔Yh再次給予熱療1次)、AD模型組、AD模型組+熱療組(造模后給藥熱療Xmin，間隔Yh再次給予熱療1次)并且末次熱療后更換培養基，繼續培養24h。②Aβ25-35溶解后配成0.5mg/mL溶液，37℃、5%CO2培養箱培養，-20℃保存備用，使用前稀釋、過濾。③4組細胞內加入20μmol/L的Aβ25-35溶液培養24h后給予5g/LMTT20μl孵育4h，棄上清加100μL二甲基亞砜(DMSO)，在酶聯免疫檢測儀570nm波長下測定各孔光吸收值，并將其與正常對照組吸光度的比值作為相對細胞活力。④流式細胞儀測定細胞凋亡：應用AnnexinV-PI雙染色檢測細胞凋亡。細胞按1×105/孔的密度接種在6孔板中，給予Aβ25-35干預6h后用PBS洗滌2次，室溫避光反應15min，應用流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 不同熱療時間對各組細胞活力的影響 對照組和AD模型組分別給予不同時間41.5℃熱療，兩組細胞在加熱初期(30min和45min)，細胞增殖趨勢分別與其對應的非加熱細胞相比相差不大；從60min開始加熱細胞增殖趨勢與非加熱細胞相比開始下降(P<0.05)，這種下降趨勢在75min達到最大，即此時在兩種培養條件下細胞的平均A值差距最大，確定細胞加熱的安全有效時間為60min，見圖1。對照熱療組與AD模型熱療組對比，兩組細胞隨溫度變化的細胞增殖趨勢基本相同，兩者比較無明顯統計學差異(P>0.05)，表明兩組細胞的最佳熱療時間均為60min。見圖2。

2.2 不同熱療時間對AD細胞HSP70表達的影響 AD模型組細胞在熱療后2、4、8、12、24及72h各時間段監測的HSP70表達量均不同，AD細胞在24hHSP70表達量均達到最大值(P<0.05)，其后HSP70表達量開始下降，表明24h是最佳的熱療間隔時間。見圖3。

2.3 深部熱療對各組細胞存活率的影響 MTT檢測結果顯示，Aβ對兩組細胞的細胞毒性與溫度相關，熱療使溫度升高后作用于P12細胞或AD細胞，使細胞活力呈溫度依賴性上升趨勢(P<0.05)，高溫對細胞活力有明顯提升作用，表明熱療可有效的減少Aβ的聚集，促進Aβ的清除，保護AD細胞，促進神經元細胞修復。見表1。

組別樣本量吸光度值存活率/%P12對照組50.741±0.01480.27±4.45P12對照組+熱療組50.643±0.022*87.46±2.21AD模型組50.736±0.00958.41±3.53AD模型組+熱療組50.619±0.017*72.02±4.18

注：與非熱療組比較，*P<0.05。

3 討論

AD是老年癡呆中最常見的一種類型，其臨床特點為記憶障礙、認知障礙和精神異常等，病情漸進性加重，嚴重影響生活與社交，其患病率隨年齡增高而增高，在65歲以上人群中約為5%，85歲以上人群中約20%，其中印度、中國等亞洲發展中國家患病率增加最為明顯[4]。

3.1 深部熱療對熱休克蛋白的影響 熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)是指各種應激刺激時細胞新合成或合成增加的一類蛋白質，它作為體內重要的分子伴侶之一，參與蛋白質的合成、折疊、裝配、轉運和降解等過程，以維持細胞蛋白自穩，提高細胞對應激原的耐受性，并有助于細胞恢復正常的結構和機能[5]。深部熱療是利用高溫產生熱刺激作用在AD患者神經中樞，神經細胞在熱刺激反應后，會發生蛋白質圖譜的改變，表現為正常蛋白合成被抑制，應激蛋白HSP合成增加，從而達到減少Aβ聚集，減少寡聚體的形成，減輕神經元細胞的損傷[6-7]。近年來深部熱療作為一種無創、無痛苦、治療費用相對低廉、無明顯毒副作用的治療方法，臨床廣泛應用于惡性腫瘤和炎癥性疾病，并取得較好的臨床收益。大量的基礎研究表明，能夠產生熱休克蛋白的深部熱療在AD患者的臨床治療上具備潛力，但缺乏系統規范的治療模式的探討及治療效果的評估[8]。本研究在離體細胞水平，在加熱的不同時間，通過MTT法測定細胞活力，AD細胞在加熱初期(30min和45min)，細胞增殖趨勢分別與其對應的非加熱細胞相比相差不大；從60min開始加熱細胞增殖趨勢與非加熱細胞相比開始下降(P<0.05)，表明AD細胞熱療的最佳時間為60min。此后AD模型組在加熱60min后觀察AD細胞在加熱后不通時間段的HSP的表達，結果表明AD細胞在24hHSP70表達量均達到最大值(P<0.05)，說明AD細胞體外加熱的最佳時間間隔為24h。

3.2 深部熱療對Aβ釋放的作用 Aβ是淀粉樣蛋白前體蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)在人體代謝的正常產物之一，神經細胞，尤其是神經膠質細胞產生Aβ后，向細胞外釋放，進入腦脊液，最終被腦啡肽酶和內皮素轉換酶分解清除。在AD患者中，隨著pH值改變和載脂蛋白E的增多導致Aβ的產生和清除失衡，使Aβ在神經元外聚集，發揮神經毒性作用，最終引起記憶缺失[9-10]。研究表明，熱休克蛋白可以有效的促進Aβ的清除，減少tau蛋白的過度磷酸化，減少神經元的丟失，促進神經突觸的可塑性，發揮保護神經細胞的作用[11-12]。 本研究中給P12神經細胞及AD細胞分別加熱，均加熱60min/次，間隔24h重復加熱1次，其后將4組細胞與Aβ溶液進行培養，熱療組細胞的存活率明顯高于非熱療組。研究表明熱療對神經細胞均有明顯保護作用，熱療產生的HSP可以有效的減少Aβ在神經元上的沉淀，促進Aβ的清除，保護AD細胞。

深部熱療可以刺激神經細胞產生大量熱休克蛋白，熱休克蛋白通過參與蛋白質的合成、折疊、裝配、轉運和降解等過程，以維持神經細胞蛋白自穩，提高細胞對應激原的耐受性，恢復AD細胞正常的結構和功能[13-14]。本研究試驗在離體細胞水平探討AD的治療模式為每次AD細胞熱療的最佳時間為60min，間隔24h重復加熱1次，可以有效抑制Aβ聚集，從而保護神經元細胞。未來，進一步的研究中我們將繼續探索大鼠頭部熱療治療AD的模式和效果，并與離體細胞水平的治療相對比，我們期待可以在將來為深部熱療在AD患者的臨床治療提供前期的理論與實驗基礎。

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The Exploration and Curative Effect of Deep Hyperthermia Treatment Model on Isolated AD Cells

CHEN Jianhong WANG Xiaopu NONG Haining BAO Jin LU Yimin*

Clifford Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 511495,China

Objective To explore the best treatment model of deep hyperthermia on isolated AD cells and evaluate its curative effect.Methods Isolated AD cells models were made ready and randomly divided into control group and hyperthermia control group, AD model group, AD model hyperthermia group. Each group was separately heated at the level of 41.5℃ for 30, 45, 60, 75, 90min，the absorbance(A) value was tested at 600 nm, and then the best hyperthermia treatment time was calculated. The ready made AD cells were heated for 60 minutes at the level of 41.5℃ and then continued to be incubated in thermotank for 24 hours at the level of 37℃ after the heating. The cells were separately taken out after 2, 4, 8, 12, 24 and 72h. Flow Cytometer was used to test the expression level of the AD cells HSP70, and the best interval of hyperthermia treatment was calculated. 4 groups of the cells were put into the Aβ25-3solution of 20μmol/L concentration to cultivate for 24 hours. The cell viability was tested by using flow cytometer to evaluate the hyperthermia treatment effects on AD. Results The control group and AD model group were separately given hyperthermia at the level of 41.5℃，the Cell proliferation trend of the two groups of cells began to decline compared with the non-heated cells(P<0.05). This trend came to the maximum at the 75th minute, and accordingly the safe and effective time length of heating on the cells was set for 60 minuets. The control hyperthermia compared with the AD model hyperthermia group, the Cell proliferation trend of the two groups which varied according to the temperature changes was generally the same, and no statistic significance was found between the two groups(P>0.05), which showed the best treatment time length of the two groups of cells was 60 minutes. The HSP70 expression level of AD model group was tested differently after the cells were heated 2, 4, 8, 12, 24 and 72h. The HSP70 expression level of AD cells was tested the top at 24h, then it began to decline. This showed the best treatment interval was 24 hours. The four groups of cells were mixed with Aβ and the mixture was then heated. MTT showed the viability of the four groups of cells was on the rising trend with temperature dependence(P<0.05), which showed hyperthermia could effectively reduce the gather of Aβ and help clear Aβ, AD cells were protected accordingly.Conclusions The best treatment time length of deep hyperthermia on isolated AD cells was 60 minutes, the best hyperthermia treatment interval was 24 hours, deep hyperthermia could effectively clear Aβ and help repair the neuron cells.

Hyperthermia; AD; Isolated Cell; Treatment Model

陳劍虹(1979 -)，男，漢族，本科，主治醫師，研究方向為老年病方向。E-mail：570686858@qq.com

盧宜民(1964 -)，男，漢族，本科，主任醫師，研究方向為腫瘤熱療學。E-mail：gzlym-10@163.com

R-331

A

1007-8517(2017)15-0058-04

2017-05-25 編輯：梁志慶)