靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織線粒體鈣和c-Fos的影響

劉 輝

（江蘇省南通衛生高等職業技術學校護理系，江蘇 南通 226001）

靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織線粒體鈣和c-Fos的影響

劉 輝

（江蘇省南通衛生高等職業技術學校護理系，江蘇 南通 226001）

目的研究靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織組織線粒體鈣和c-Fos的影響。方法對健康雄性Wistar大鼠45只進行建模，隨機分成對照組（生理鹽水腹腔注射+生理鹽水灌胃），模型組（PTZ腹腔注射+生理鹽水灌胃），靈芝孢子粉組（PTZ腹腔注射+靈芝孢子粉灌胃），每組各15只，采用火焰原子吸收法測定3組腦組織線粒體Ca2+的水平，免疫組織化學方法檢測腦組織c-Fos。結果c-Fos在大鼠皮質區、海馬區均可見表達。與對照組和模型組比較，靈芝孢子粉組的c-Fos表達水平明顯降低（P＜0.05）；靈芝孢子粉組的線粒體Ca2+水平明顯增加（P＜0.05）。結論靈芝孢子粉通過增加線粒體Ca2+水平及抑制c-Fos的表達來減少癲癇發作對腦細胞線粒體所造成的損傷，進而達到抗癲癇的效果。

靈芝孢子粉；癲癇；大鼠；腦組織；線粒體鈣；c-Fos

癲癇屬于一種比較常見的神經系統疾病，此病對患者的生存質量危害比較大[1]。目前，治療癲癇的藥物比較多，但是效果不盡相同[2-3]。同時，一些新的抗癲癇藥物也隨著藥物學的發展而不斷出現，雖然在抗癲癇方面獲得了突破性進展，但是對于難治性癲癇尚是一大頑疾，有待新的治療此類難治性癲癇的藥物的出現。靈芝孢子粉是近年來人們比較關注的一類藥物[4]，但是關于其在抗癲癇過程中的作用機制尚不是很明確。本研究著重探討靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織組織線粒體鈣和c-Fos的影響，以揭示靈芝孢子粉在抗癲癇中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料。靈芝孢子粉：購自山東云海靈芝專業合作社；戊四氮（PTZ）：購自上海博頓生物化工有限公司；兔抗大鼠c-Fos多克隆抗體：購自武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒：購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗動物分組：健康雄性Wistar大鼠36只，體質量152～234 g，普通級動物，由某醫科大學動物實驗中心提供。實驗過程中大鼠的處置符合動物倫理學標準。依據體質量把45只大鼠隨機分成3組：分成對照組（生理鹽水腹腔注射+生理鹽水灌胃），模型組（PTZ腹腔注射+生理鹽水灌胃），靈芝孢子粉組（PTZ腹腔注射+靈芝孢子粉灌胃），每組各15只。

1.3 腦組織細胞線粒體鈣測定：將3組大鼠運用斷頭低溫快速取出大腦，腦膜給予剔除干凈之后，運用蔗糖-Tris緩沖液及玻璃勻漿器把腦組織制作成勻漿，實施差速離心，獲得線粒體沉淀物，收集線粒體懸液在陰暗處進行硝化1周。使用原子火焰吸收分光計對線粒體鈣吸光度進行測定。

1.4 腦組織c-Fos的測定：將3組大鼠麻醉后進行斷頭處死操作，低溫下快速取腦，并分離出海馬組織，運用中性甲醛溶液對其行24 h以上的固定操作，接著采用PBS水給予沖洗5次，使用酒精梯度實施脫水之后，運用石蠟進行包埋大腦皮質和海馬組織，采用錫紙包裹好之后置入冰箱中用于腦組織c-Fos的檢測。

使用免疫組織化學方法測定各組大鼠大腦皮質和海馬組織中的c-Fos水平，操作步驟分別嚴格按照兔抗大鼠c-Fos試劑盒說明書操作。染色切片在BI-2000醫學圖像分析系統顯微鏡下觀察，呈棕黃色顆粒者為陽性。每張切片觀察10個有代表性的視野，并計數每一個視野的陽性細胞數以檢測c-Fos的表達情況。

1.5 統計學處理：應用SPSS 20.0統計分析軟件包進行統計分析。計量資料采用表示，組間比較采用t分析，計數資料采用χ2分析，均以α=0.05作為檢驗水準，P＜0.05具有統計學差異。

2 結 果

2.1 各組大腦組織織線粒體Ca2+比較：與對照組和模型組比較，靈芝孢子粉組的織線粒體Ca2+含量明顯增加（P＜0.05），見表1。

表1 各組大腦組織織線粒體Ca2+比較（μg/mL，

表1 各組大腦組織織線粒體Ca2+比較（μg/mL，

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，aP＜0.05

組別n皮質區海馬區對照組155.57±0.849.64±1.73模型組157.14±1.23*11.16±2.56*靈芝孢子粉組159.43±2.05*a18.82±3.41*a

2.2 各組大腦組織c-Fos表達水平比較：與對照組和模型組比較，靈芝孢子粉組的c-Fos表達水平明顯減少（P＜0.05），見表2。c-Fos表在大鼠皮質區的表達見圖1～2；c-Fos表在大鼠海馬區的表達見圖2。

表2 各組大腦組織c-Fos表達水平比較（個/視野，

表2 各組大腦組織c-Fos表達水平比較（個/視野，

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，aP＜0.05

組別n皮質區海馬區對照組1525.34±2.1421.15±5.37模型組1563.57±4.27*43.56±9.64*靈芝孢子粉組15124.35±5.16*a86.24±10.35*a

3 討 論

一般情況下，Ca2+對神經細胞膜興奮性具有穩定及維持的作用，如果血液中的Ca2+水平減少，則神經細胞膜電位就會出現不穩定，進而激發癲癇的發作，產生異常放電[5-7]。因此，Ca2+水平發生失衡為癲癇發病的一個可能機制。本研究顯示，與對照組和模型組比較，靈芝孢子粉組的線粒體Ca2+水平明顯增加（P＜0.05）。說明，靈芝孢子粉可以調節Ca2+含量而對神經元起到一定的保護作用。

相關研究表明[8-9]，癲癇發作時c-Fos會發生改變。由此可見，c-Fos在一定程度上可以反映出神經元之興奮狀態，通過c-Fos的影響因素進行干預，能夠調節c-Fos的表達，使之上調或者下調[10]。本研究顯示，c-Fos在大鼠皮質區、海馬區均可見表達。與對照組和模型組比較，靈芝孢子粉組的c-Fos表達水平明顯降低（P＜0.05）。說明，靈芝孢子粉是通過減少腦內c-fos基因表達的途徑來起到抗癲癇的效果。

圖1 c-Fos表在大鼠皮質區的表達（DAB，×200）

圖2 c-Fos表在大鼠海馬區的表達（DAB，x200）

綜上所述，靈芝孢子粉通過增加線粒體Ca2+水平及抑制c-Fos的表達來減少癲癇發作對腦細胞線粒體所造成的損傷，進而發揮抗癲癇的作用。

[1] 趙璐,王淑秋,王喆.靈芝孢子粉對戊四氮致癇大鼠腦組織GDNF與NT-3表達的影響[J].中國病理生理雜志,2010,26(4):812-815.

[2] Deshpande LS,Lou JK,Mian A,et al.Time course and mechanism of hippocampal neuronal death in an in vitro model of status epilepticus: Role of NMDA receptor acti- vation and NMDA dependent calcium entry[J] .Eur J Pharmacol,2008,583(1):73-83.

[3] Faught E,Richman J,Martin R,et al.Incidence and prevalence of epilepsy among older US Medicare beneficiaries[J]. Neurology,2012, 78(7):448-453.

[4] 趙春霞,郝冰.靈芝孢子粉對戊四氮致癇大鼠NGF的影響[J].牡丹江醫學院學報,2013,34(2):28-29.

[5] 趙爽,張勝昌,王淑秋.靈芝孢子粉對戊四氮慢性點燃大鼠學習記憶及膽堿乙酰轉移酶、乙酰膽堿酯酶活性的影響[J].中國老年學雜志,2013,33(1):354-356.

[6] 趙春霞,郝冰.靈芝孢子粉對戊四氮致癇大鼠 NGF 的影響[J].牡丹江醫學院學報,2013,34(2):28-29.

[7] Goodkin HP,Yeh JL,Kapur J.Status epilepticus increases the intracellular accumulation of GABAA receptors[J].J Neurosci, 2005,25(23):5511-5520.

[8] van Drongelen W,Lee HC,Hereld M,et al.Emergent epileptiform activity in neural networks with weak excitatory synapses[J]. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng,2005,13(2):236-241.

[9] Sun C,Mtchedlishvili Z,Bertram EH,et al.Selective loss of dentate hilar interneurons contributes to reduced synaptic inhibition of granule cells in an electrical stimulation- based animal model of temporal lobe epilepsy[J].J Comp Neurol,2007,500(5):876-893.

[10] 趙璐,王淑秋,王喆.靈芝孢子粉對戊四氮致癇大鼠腦組織GDNF與NT-3表達的影響[J].中國病理生理雜志,2010,26(4):812-815.

R742.1

B

1671-8194（2017）22-0051-02

江蘇省衛生科研項目JZ201319