應用骨髓間充質干細胞復合關節軟骨脫細胞基質修復兔軟骨缺損的實驗研究

張志勇 于光屹 陶丹丹 王惠亭 方世宇

（大連大學附屬新華醫院骨科，遼寧 大連 116021）

應用骨髓間充質干細胞復合關節軟骨脫細胞基質修復兔軟骨缺損的實驗研究

張志勇 于光屹 陶丹丹 王惠亭 方世宇

（大連大學附屬新華醫院骨科，遼寧 大連 116021）

目的研究骨髓間充質干細胞（BMSCs）復合關節軟骨脫細胞基質修復兔關節軟骨缺損的效果。方法選取36只3～4個月齡的健康新西蘭兔，分離其骨髓間充質干細胞（BMSCs），并在體外進行培養擴增。將BMSCs與關節軟骨脫細胞基質在體外培養瓶中進行復合培養約3 d。將實驗對象隨機分為3組，分別進行3種不同的處理，實驗結果用關節軟骨組織學評分標準進行評分。結果移植手術后12周，移植培養好的骨髓間充質干細胞和關節軟骨脫細胞基質復合物的實驗組修復組織和周圍組織整合良好，且修復效果顯著優于移植單獨的關節軟骨脫細胞基質組和空白對照組。結論應用骨髓間充質干細胞和關節軟骨脫細胞基質的復合物能有效的修復兔關節軟骨缺損。

骨髓間充質干細胞；關節軟骨脫細胞基質；軟骨缺損；組織工程學

關節軟骨能通過緩解關節壓力來維持關節的正常功能，在關節的活動中起著至關重要的作用[1]。軟骨損傷是一種非常常見的骨科疾病，通常由創傷、腫瘤或感染等原因造成，是臨床治療中一個非常棘手的問題[2-5]。本研究用骨髓間充質干細胞作為種子細胞，用關節軟骨脫細胞基質作為支架材料，將二者形成的復合物移植到兔軟骨缺損部位。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：選取36只3～4個月齡的健康新西蘭兔，體質量約3.0 kg，購買自大連醫科大學動物實驗中心。

1.2 實驗試劑及儀器：DMEM培養液、胰蛋白酶、胎牛血清、二氧化碳培養箱。

1.3 骨髓間充質干細胞的分離與體外培養：BMSCs的分離與體外培養采用密度梯度離心法，具體參見穆曉紅等[5]研究方法。

1.4 關節軟骨脫細胞基質的制備：關節軟骨脫細胞基質的制備主要利用冷凍干燥、化學去污劑等方法制備脫細胞的兔關節軟骨，具體參見武天佑等[6]文獻中所用方法。

1.5 BMSCs和關節軟骨脫細胞基質體外復合培養：BMSCs和關節軟骨脫細胞基質體外復合培養根據楊強等[7]研究中所用方法進行。

1.6 制備兔軟骨缺損模型：通過耳緣靜脈注射方法麻醉所選取的36只新西蘭兔，用直徑為5 mm的鉆孔儀在兔股骨踝關節面鉆2～3 mm深的孔，制備兔雙側膝關節軟骨缺損模型。

1.7 實驗分組及移植方法：將所制備的36只軟骨缺損模型的新西蘭兔隨機分成3組，每組各12只，分別進行3種不同的處理：第Ⅰ組兔軟骨缺損部位移植培養好的骨髓間充質干細胞和關節軟骨脫細胞基質復合物；第Ⅱ組移植單獨的關節軟骨脫細胞基質；第Ⅲ組不做任何移植處理。在手術后4、8、12周分別處死4只新西蘭兔，取雙側膝關節組織，然后通過免疫組織化學的方法進行染色，并觀察缺損組織的修復情況。

1.8 統計學分析：實驗結果參照Sellers關節軟骨組織學評分標準進行評分，并利用SPSS13.0分析各實驗組間是否存在顯著性差異。數值均以平均值±標準差表示，統計學分析采用t檢驗，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結 果

2.1 實驗用新西蘭兔統計：本研究選取36只3～4個月齡的健康新西蘭兔，隨機分為3組，每組12只，整個實驗過程中無意外死亡或損失，全部計入結果分析。

2.2 體外分離及培養骨髓間充質干細胞：常規方法分離培養兔骨髓間充質干細胞，并利用免疫染色的方法鑒定了骨髓間充質干細胞，發現BMSCs特異性高表達抗原CD44，而不表達層粘連蛋白和CD34，表明我們分離機培養的骨髓間充質干細胞是正確的。

2.3 制備關節軟骨脫細胞基質的支架材料，并研究其特性：Massion染色結果可見關節軟骨脫細胞基質中存在很多的軟骨陷窩且其周圍存在大量的膠原纖維。掃描電鏡觀察發現脫細胞基質中沒有殘存的細胞器或細胞核，表明脫細胞基質的分離非常干凈。

2.4 觀察并評估BMSCs和關節軟骨脫細胞基質的復合物對兔軟骨缺損的修復效果：對3組新西蘭兔進行移植處理后首先觀察其運動狀態和健康情況，發現經過手術處理的兔子剛開始很少運動，但隨著時間不斷地進行自我恢復后，其運動情況逐漸恢復正常，步態姿勢正常且術后2周左右基本恢復健康。

形態學觀察，發現第Ⅰ組新西蘭兔在移植手術后，修復效果較好，對3組實驗觀察評分具體結果見表1。統計學分析發現，第Ⅰ組移植骨髓間充質干細胞復合關節軟骨脫細胞基質的修復效果與第Ⅱ組單獨移植關節軟骨脫細胞基質和第Ⅲ組不做移植處理的空白組相比都有顯著提高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組術后12周大體觀察評分統計結果（

表1 各組術后12周大體觀察評分統計結果（

注：*代表與第Ⅲ組比較P＜0.05，#代表與第Ⅰ組比較P＜0.05

組別表面平整填補缺損深度與正常軟骨組織融合總分Ⅰ0.79±0.32*0.83±0.411.02±0.57*2.63±0.78Ⅱ1.57±0.65*1.71±0.86#1.63±0.45*4.93±1.14#Ⅲ2.45±0.872.48±0.81#2.57±0.827.85±1.23#

3 討 論

組織工程研究的核心內容是將細胞和生物材料通過一定的方法構建成具有生命力的活體組織，進一步用重新構建的具有正常生物功能的活體組織來替換機體內相應的受損組織，并通過與周圍的正常組織完整的融合來達到治療目的，最終維持機體的正常功能。

本研究應用體外分離培養的骨髓間充質干細胞作為實驗的種子細胞，用關節軟骨脫細胞基質作為支架材料，在體外將骨髓間充質干細胞和關節軟骨脫細胞基質通過生物醫學的方法構建成具有生命力的活體組織，進而將二者形成的復合物移植到兔關節軟骨的缺損部位并觀察修復結果。從組織學和免疫組織化學的角度分別觀察和對比了實驗組和對照組，發現該復合物相比對照組而言能有效地與周圍組織融合并維持兔軟骨的正常代謝和功能，從而非常有效地修復兔關節軟骨的損傷，這表明應用骨髓間充質干細胞復合關節軟骨脫細胞基質可以用于修復兔軟骨損傷。

[1] 徐敬,趙建寧,徐海棟,等.關節軟骨損傷修復研究進展[J].臨床與病理雜志,2015,35(3):455-461.

[2] 阮征,尹慶水,張余.關節軟骨損傷修復技術的研究與進展[J].中國組織工程研究,2014(29):4724-4729.

[3] 王巖,李德華.骨髓間充質干細胞復合多肽凝膠及成軟骨生成因子修復兔關節軟骨缺損[J].中國組織工程研究,2015,19(1):30-36.

[4] 張志勇.轉導人端粒酶逆轉錄酶基因致人骨髓間充質干細胞永生化的研究[D].大連:大連醫科大學,2009.

[5] 穆曉紅,趙子義,徐林,等.密度梯度離心法體外培養骨髓間充質干細胞的分化能力[J].中國組織工程研究,2011,15(27):4955-4958.

[6] 武天佑,夏亞一,王栓科,等.關節軟骨脫細胞支架材料的制備[J].中國組織工程研究,2007,11(18):3601-3603.

[7] 楊強,彭江,盧世璧,等.軟骨脫細胞基質多孔支架與骨髓基質干細胞體外構建組織工程軟骨的研究[J].中華醫學雜志,2011,91 (17):1161-1166.

R329

B

1671-8194（2017）22-0053-02