基于ISSR技術和非腺毛特征研究柔毛淫羊藿和近緣種遺傳關系和居群遺傳多樣性

劉翔 付長珍 高敏 植漢成 楊相波 郭寶林

[摘要]該研究對柔毛淫羊藿14個居群和星花淫羊藿1個居群共128個單株進行ISSR分析，用POPGENE計算相關系數，UPGMA進行聚類分析，以及用光學顯微鏡觀察了每個居群葉背主要非腺毛類型和特點。研究發現：非腺毛可分為5個形態類別，分別為長直毛、長卷曲毛、伏卷曲毛、擬短伏毛和長伏毛；篩選出的8個ISSR引物共擴增出94個條帶，其中多態性條帶90個，基于ISSR聚類分析結果，15個居群分為3個分支，星花淫羊藿居群并沒有單獨為一支，應不能獨立成種，應并入柔毛淫羊藿或者作為柔毛淫羊藿的種下等級；柔毛淫羊藿居群間遺傳關系與地理分布及非腺毛特征具有良好的相關性，但也存在不一致的情況，這對于進一步研究柔毛淫羊藿以及淫羊藿屬植物的種間關系和成種方式提供了良好的提示。居群多樣性分析表明柔毛淫羊藿居群的基因流Nm為0354 4，Nei′s基因分化系數為0585 2，說明居群間表現出較高水平的遺傳分化，主要原因可能來自柔毛淫羊藿居群自交率高和種子散布范圍小。

[關鍵詞]柔毛淫羊藿； 星花淫羊藿； 居群； 非腺毛； ISSR分子標記； 遺傳多樣性

Genetic relationship and population genetic diversity of

Epimedium pubescens and its related species based on ISSR and

nonglandular hair characteristic

LIU Xiang1，2， FU Changzhen1， GAO Min1， ZHI Hancheng3， YANG Xiangbo4， GUO Baolin1*

（1 Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Science， Peking Union Medical College， Beijing 100193， China；

2 Chongqing Academy of Chinese Materia Medica， Chongqing 400065， China；

3 Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330006， China；

4Guizhou Tongjitang Pharmaceutical Co， Ltd， Guiyang 550002， China）

[Abstract]In this study， 128 individuals form 14 Epimedium pubescens populations and 1 E stellulatum population were analyzed by ISSR marker The data were calculated by POPGENE software and clustered by UPGMA method Optical microscope was used to observe the main types of the nonglandular hairs and their characteristics in each population It is found that the following conclusions： Nonglandular hairs can be divided into five morphological categories， long straight pubescent， curly pubescent， appressed curly pubescent， pseudo short appressed hairs and long appressed Eight primers were screening and a total of 94 bands were detected in ISSR， among which 90 were polymorphic bands Based on the results of ISSR cluster analysis， 15 populations were divided into 3 clades E stellulatum populations should be incorporated into the E pubescens or as avariety under E pubescens not be independent and as it has no separate phylogenetic branch for a cluster The genetic relationship among the populations of E pubescens was closely related with its geographical distribution and nonglandular hair features But there were also some inconsistency， which provided a good hint for the further study on the interspecific relationship and natural speciation manner of Epimedium species Population diversity analysis showed Nm=0354 4， Nei′s=0585 2 It was showed that E pubescens has high genetic diversity among populations， for which the main reason was probably the high inbreeding rate and the small range of seed dispersalendprint

[Key words]Epimedium pubescens； Epimedium stellulatum； populations； nonglandular hairs； ISSR； genetic diversity

柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim是小檗科淫羊藿屬植物，為《中國藥典》“淫羊藿”收載來源物種[1]，也是多個來源物種中資源量最大的種類。主要分布于四川盆地及其周圍山系、重慶西北部和陜西南部，甘肅的最南端也有少量分布，分布的北界為陜西的太白山，南界為四川的宜賓，西界為四川的寶興，東界為重慶的潼南。柔毛淫羊藿生于海拔300～2 000 m的灌叢中、林下，山坡或山溝蔭濕處[2]。

簡單重復序列區間擴增多態性標記技術（intersimple sequence repeat，ISSR）是由Zietkiewicz等[3]創建的一種分子標記，能在分子水平上提供大量的遺傳信息，具有重復性好、多態性豐富、操作簡單等優點；呈孟德爾式遺傳，具顯性或共顯性特點，廣泛應用于藥用植物品種鑒定、遺傳多樣性、進化和系統發育等方面的研究中[45]。

淫羊藿屬植物豐富的種間種內形態變異，復雜的種間雜交關系，是植物界中分類學和系統發育最具挑戰性的類群之一[6]，用RAPD，RFLP，ITS，AFLP，iPBS，以及葉綠體全基因組等分子標記分析淫羊藿屬植物的遺傳關系的報道較多[610]。陳燕英等研究發現ISSR標記可很好揭示7種川產淫羊藿屬種間親緣關系[11]。本研究采用ISSR技術分析了柔毛淫羊藿及葉和花形態與柔毛淫羊藿極為相似的近緣種星花淫羊藿E stellulatum 15個居群共128個個體的遺傳關系，并結合本課題組以往在植物形態和非腺毛形態方面的研究積累，分析這二者之間遺傳關系，并探討柔毛淫羊藿種下的遺傳多樣性和該物種的遺傳結構。

1材料

11樣品供試材料為野外采集后活體保存在貴州同濟堂淫羊藿種質資源圃，全部由郭寶林研究員鑒定，憑證標本存放于中國醫學科學院藥用植物研究所（IMD）。本研究共涉及柔毛淫羊藿14個居群和近緣種星花淫羊藿1個居群（來自湖北十堰），共128個個體樣品，采集時間為2011年4月，采集植株上的健康幼嫩葉片，放入裝有硅膠的自封袋，干燥，備用（表1）。

12儀器Gel Doc XR凝膠成像儀（美國，BioRad），LongGeneMG96+/96 G Thermol cycle PCR儀，TG16W高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），綜合純水儀ELGAPURE Classic型（英國，ELGA），JY300電泳儀（北京君意東方電泳儀器設備有限公司），ZEISS Axio Imager A1光學顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）。

DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），Taq酶（TOYOBO），Trans 2K Plus DNA Maker、dNTPs（北京金式金生物技術有限公司），瓊脂糖（進口分裝），其余為國產分析純試劑。

2方法

21非腺毛觀察每份樣品取5片葉片，分別于葉脈中部，葉緣兩側、葉柄及葉片頂端5部分取樣，置于潔凈載玻片上，水合氯醛透化，稀甘油封片。樣品制片后在顯微鏡下觀察下表皮毛茸整體特征，攝影并測量統計。

22DNA 提取采用CTAB法[15]提取基因組DNA，因樣品含多糖，增加了去多糖處理，即稱取約30 mg干燥葉片，于液氮中研磨，將粉末轉移至離心管，每管加入1 400 μL去多糖溶液，冰浴10 min、離心、棄去上清液，之后采用天根試劑盒提取基因組DNA。

23ISSR引物的篩選ISSR引物根據加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的序列設計，由北京奧科生物科技有限公司公司合成，共100條引物，從中篩選出8條擴增條帶清晰、特異性條帶多、反應穩定的引物用于全部15個居群128份DNA 樣品ISSR分析（表2）。

24ISSRPCR擴增與檢測ISSR反應體系：總體積25 μL，內含Taq酶（5 U·L-1）015 μL，10×Easy Taq DNA Polymerase Buffer（含Mg2+）25 μL，25 mmol·L-1dNTP 2 μL，引物12 μL，模板DNA 1 μL（DNA量1～2 ng），ddH2O 1815 μL。

擴增程序： 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min（每個循環-1 ℃直到 48 ℃），72 ℃延伸1 min 50 s，需6個循環，再94 ℃ 1 min，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 50 s，34 個擴增循環； 72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

電泳條件：PCR擴增產物以15%瓊脂糖凝膠檢測，80 V恒壓10 min，接著130 V恒壓30 min，使用Bio Rad凝膠成像儀照相。

25數據的采集、統計用Bio Rad凝膠成像儀自帶的Quantity One 軟件，并結合人工讀帶。按照相同遷移位置上有擴增帶記為1，無記為0，強帶和弱帶均賦值為1，統計得到0，1矩陣，用于數據分析。采用POP2GEN32軟件對其進行分析，得到各相關參數：Nei′s基因多樣度指數（H）、Shannon′s表型指數（I）、群體分化系數（Gst）、多態性條帶百分率（PPB）、觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、群體總基因多樣性（Ht）、群體內基因多樣性（Hs）、Nei′s遺傳距離（D）和遺傳一致度，并根據Nei′s遺傳距離利用UPGMA法分析各居群間的遺傳分化關系。利用NTSYS pc21對柔毛淫羊藿各個體進行聚類分析，并進一步利用AMVOA 155軟件分析柔毛淫羊藿居群內和不同居群間的變異。

3結果與分析

31不同居群的非腺毛特征淫羊藿的非腺毛結構可以分為3個部分，基細胞（指非腺毛與表皮細胞相連接的細胞，一般偏小，壁薄）、伸長細胞（指基細胞與頂細胞之間，相對基細胞明顯伸長的細胞，壁厚與頂細胞相同，部分情況缺）和頂細胞（末端的一個細胞，頂端尖，偶鈍，壁常加厚）[12]。柔毛淫羊藿的非腺毛由基細胞和頂細胞兩部分構成，頂細胞一般占毛長的80%以上（e類頂細胞占毛長的46%以上），可以分為5種類型：a類長直毛，毛長140～950 μm，直徑6～25 μm，形狀平直，呈劍形，頂細胞與基細胞連接無夾角，基細胞緊縮。SCQW，SCQS，SCCZ，SCQL，SCBC，SCDJY，SCQCS，SCBZ，CQTN 9個居群皆為此種類型，是柔毛淫羊藿非腺毛的主要類型；b類長卷曲毛，長390～1 250 μm，直徑12～25 μm，頂細胞卷曲狀，與基細胞連接無夾角，基細胞緊縮，SCLC，SCYA的樣本為此種類型；c類伏卷曲毛，長410～1 220 μm，直徑12～25 μm，頂細胞卷曲狀，與基細胞T型相接，基細胞緊縮，SCHY的樣本為此種類型；d類擬短伏毛，長120～380 μm直徑175～25 μm，頂細胞與基細胞直接相接，但鄰近銜接處，頂細胞發生彎曲而形成假T形相接，SCCD居群屬此種類型；e類長伏毛，長350～700 μm，直徑75～15 μm，基細胞為1～2個伸長細胞，頂細胞與伸長的基細胞以直角或偏斜T型相接，SXNZ居群和星花淫羊藿HBSY居群屬此類型（圖1）。endprint

32ISSR遺傳距離和遺傳一致度利用POPGENE計算了居群間Nei′s遺傳距離（D）和遺傳一致度（I）。D變化范圍為 0111 5～0431 2，平均 0257 8，I的變化范圍為0649 7～0894 5，平均 0774 3（表3），其中采自于SCDJY，SCQCS的這2個居群的I最高（0894 5），SCCD，CQTN的I最低（0649 7）。

33ISSR聚類分析基于遺傳一致度，利用 UPGMA法進行聚類分析，建立15個居群柔毛淫羊藿親緣關系樹狀圖（圖2）。15個居群的柔毛淫羊藿聚為3大類：第Ⅰ類最為復雜，包括SCQW，SCQS，SCCZ，SCQL，SCBC，SCLC，SCDJY，SCQCS，SCHY，SCBZ 10個居群；第Ⅱ類有HBSY，SXNZ，SCCD，SCYA 4個居群；第Ⅲ類為CQTN 1個居群。

利用NTSYS pc21 對所有個體進行聚類分析，結果表明共有11個居群為全部個體聚在一起，各自成為一個獨立分支，如SCHY，SCQW，SCCZ，SCQL，SCBC，SCCD，SCDJY，SCQCS，CQTN，HBSY，SXNZ。另外的4個居群中，SCQS的12個個體中，9個體聚為獨立一支，2個個體和SCBZ的11個體聚為一個分支；SCLC的11個個體中，5個個體單獨聚在一起，離CQTN的分支比較近，另外6個聚為一支，與SCYA的3個比較近；SCBZ的13個個體中，11個個體和SCQS的2個個體聚為一支，2個個體和SCYA的1個個體聚為一支；SCYA的4個個體中，除了3個個體和SCLC的6個個體聚在一起外，還有1個個體和SCBZ的4個體聚為一支（圖3）。

34不同居群的遺傳多樣性通過8個引物對柔毛淫羊藿14個居群和1個星花淫羊藿居群共128個個體進行ISSR分析，共檢測出94個位點，其中多態性位點90個。在物種水平上，多態位點百分率（PPB）9574%，Nei′s基因多樣性（H）和Shannon信息指數（I）分別是0319 7±0149 7，0483 4±0190 6。在居群水平上多態位點百分率（PPB）3617%，Nei′s基因多樣性（H）和Shannon信息指數（I）分別是0129 8±0039 1，0193 5±0058 3。從各個居群來看，SCBZ，SCLC，SCQS這3個居群遺傳多樣性水平最高，多態位點百分率在5106%～5638%，SCDJY，SCCD，HBSY遺傳多樣性水平最低，多態位點在1702%～2234%，各居群的Shannon′s信息指數（I）變化趨勢與多態位點一致（表4）。

35不同居群的遺傳分化和基因流用POP2GEN32計算出的不同居群柔毛淫羊藿遺傳變異分析結果表明，基因流Nm為0354 4。Ht為0314 2，Hs為0130 3，各個居群之間的Nei′s基因分化系數Gst=（Ht-Hs）/Ht為0585 2，即表明：在物種水平上，有4148%的遺傳變異存在于居群內，而5852%的遺傳變異存在于居群間。

AMVOA對各群體的分析結果，在總的遺傳變異中有4435%存在于居群內，有5565%存在于居群間（表5），這一結果與Gst結果基本一致。說明柔毛淫羊藿各居群之間表現出較高水平的遺傳分化。

4討論

41柔毛淫羊藿和星花淫羊藿關系探討星花淫羊藿E stellulatum是Stearn根據Roy Lancaster采自湖北武當山紫云廟，種植于Royal Botanic Gardens的栽培植株發表的新種，據Stearn記載，該種植物曾由Mikinori Ogisu引自四川江油。Stearn描述星花淫羊藿與柔毛淫羊藿的形態區別點在于：前者的葉片卵形，花梗密被腺毛，內萼片披針形，長約12 mm，寬約3 mm，花瓣有微瓣片，花藥黃色；后者的葉片卵形、狹卵形和披針形，花梗被腺毛，內萼片披針形或狹披針形，長5～7 mm，寬15～35 mm，花瓣無基部瓣片[17]。基于本研究組的大量野外調查和多居群形態觀察，柔毛淫羊藿葉片形狀從狹披針形到卵形，小花梗從不被腺毛到密被腺毛，內萼片的大小、有無輕微瓣片和瓣片的長短、花藥由綠色到黃色都是有過渡類型的。如四川北部江油、平武、北川、松潘等地的柔毛淫羊藿內萼片較大，長8～12 mm，寬25～4 mm，具微瓣片，葉多為狹披針形至披針形，葉背非腺毛多為直毛，花藥綠色。瓣片的有無在淫羊藿屬植物是重要的鑒別特征，但在小花類型的柔毛淫羊藿中，花瓣片從不明顯到1 mm，再到2 mm與距等長等情況有逐漸過渡，實難合理劃分界限。因此星花淫羊藿穩定區別于柔毛淫羊藿的植物形態特點只在葉片形狀，而花序和花的特征，特別是星花淫羊藿種名來自于“花大如星星”的特征實際在柔毛淫羊藿的變異范圍內。本文的ISSR分析支持該結果，星花淫羊藿（HBSY居群）先與柔毛淫羊藿的四川雅安SCYA這一居群聚在一起，后與陜西南鄭SXNZ和四川昌都SCCD居群聚在一起，此外，從非腺毛形態看，星花淫羊藿的非腺毛和柔毛淫羊藿陜西南鄭居群為一個類型，說明從花形態、遺傳關系上和非腺毛特征上，星花淫羊藿都在柔毛淫羊藿的變化范圍內，且與柔毛淫羊藿的陜西居群關系密切。

值得關注的是，本研究組發現分布于湖北十堰HBSY的星花淫羊藿葉片中淫羊藿苷、朝藿定A，B，C等異戊烯基黃酮類成分的含量極低或不含，而柔毛淫羊藿的所有居群此類成分含量明顯且較高[18]。基于已有數據和上述研究，星花淫羊藿應不能獨立成種，并入柔毛淫羊藿，或者定為一個種下等級，還待于進一步的研究。

42遺傳差異和形態地理的關系分析柔毛淫羊藿主要分布于四川盆地及其周圍山系，向北跨過大巴山系到達秦嶺山系（即陜西南部和湖北西北部）。一般來說由于地理隔離一方面阻斷了基因交流，另一方面環境差異促進了遺傳的分化，所以地理距離與遺傳距離呈現較好的相關性。研究得到的所有居群UPGMA聚類圖（圖1）在地理距離和遺傳關系上有一定聯系，如SCQL，SCDJY，SCQCS 3個居群地理距離較近聚在一起。其中個體聚類分析（圖3）比居群聚類分析表現出更高的地理分布聯系，如SCQW，SCHY聚在一起，CQTN，SCLC 5個個體聚在一起。造成個體聚類與居群聚類不一致的原因之一是SCQS，SCBZ，SCLC，SCYA 4個居群發生了分化，也就是一個居群不同個體與不同的居群發生了聚類，同樣個體聚類分析與非腺毛形態的關系也更為一致，如：同樣為e類長伏毛的HBSY，SXNZ聚在一起，同為b類長卷曲毛的SCLC 6個個體和SCYA 3個個體聚在一起。但是地理分化和非腺毛形態表型與遺傳聚類分析還是有諸多不一致。梁瓊等通過AFLP分子標記對箭葉淫羊藿E sagittatum 12個不同居群形態及遺傳多樣性比較研究，結果發現聚類關系與地理分布密切相關，形態聚類與遺傳聚類分析還是有諸多不一致，而且形態聚類與地理分布的相關性也低于遺傳聚類，表明箭葉淫羊藿形態的多樣性與遺傳關系之間聯系的復雜性[13]；植物類群的多型現象是地理分化和生態分化的結果，但就產生變異和分化的內在機制而言，表型可塑性變化、生態宗的分化、地理宗的分化以及地理梯度的變異、染色體變異，特別是染色體多倍化、種間雜交和無融合生殖等，都是重要的因素，而且通常多少會對植物的外部形態產生影響[14]。說明柔毛淫羊藿遺傳多樣性的復雜性，除了常見的地理距離和形態多樣性以外，可能與柔毛淫羊藿與同屬其他物種雜交的結果，如SCCD居群出現擬短伏毛與箭葉淫羊藿和粗毛淫羊藿常見的短伏毛比較類似，是SCCD居群獨立進化而來還是與箭葉淫羊藿或粗毛淫羊藿發生了雜交而來，值得進一步研究。endprint

43不同居群非腺毛與遺傳關系的聯系非腺毛是由植物表皮細胞特化而成的突起物，其顯微結構特征可因為植物種類不同而有相當大的變化，不少研究表明，非腺毛形態可作為物種分類的重要依據[15]。前人對淫羊藿屬植物植物非腺毛進行了研究，認為淫羊藿屬植物葉背非腺毛結構特征專屬性強，在種間存在差異，具有分類學價值[16]。但多數研究針對某一種類只進行了1個或少數幾個居群的研究，沒有進行多個居群的研究，筆者通過對多個居群淫羊藿屬植物非腺毛研究發現，分布范圍廣的物種如箭葉淫羊藿E. sagittatum、天平山淫羊藿E. myrianthum、柔毛淫羊藿等具有多個類型的非腺毛，本文將柔毛淫羊藿的非腺毛細分為5個類型。

柔毛淫羊藿最常見的是a類長直毛，而且在具有b～e類型毛居群的非腺毛中或多或少能看見a類長直毛，所以柔毛淫羊藿中a類長直毛是最典型也是最原始的非腺毛，b等類型為次生類型。短伏毛成都居群和e類長伏毛陜西南鄭和湖北十堰屬于聚類分析的第Ⅱ類。筆者通過ISSR分子標記與不同居群的非腺毛進行了比較，伏毛和直毛在遺傳多樣性上分為2類。

在僅具有a類長直毛9個居群其中8個居群屬于ISSR基于遺傳一致度聚類分析的第Ⅰ類，CQTN居群屬于遺傳一致度聚類分析的第Ⅲ類，b類長卷曲毛SCLC居群和c類伏卷曲毛SCHY居群也屬于第Ⅰ類，b類長卷曲毛SCYA居群屬于第Ⅱ類，b類長卷曲毛應該是在a類長直毛基礎上的變異類型，即頂細胞發生了卷曲，c類伏卷曲毛又在b類長卷曲毛基礎發生了頂細胞與基細胞產生夾角。洪雅c類伏卷曲毛，雖然也屬伏毛大類，可能因為與其他直毛居群地理間隔較近，遺傳多樣性仍然歸為Ⅰ類，另外3個居群2種伏毛，d類擬短伏毛和e類長伏毛歸為Ⅱ類。

44遺傳多樣性和遺傳結構遺傳多樣性一般是指種內的遺傳差異水平，反映一個物種適應環境的能力及其被改造和利用的潛力。本研究應用篩選到的 8條ISSR 引物在15個不同居群柔毛淫羊藿中檢測到了較豐富的遺傳多樣性，多態位點百分率（PPB）達到9574%，Shannon（I）多樣性指數0483 4±0190 6。如此豐富的遺傳多樣性，說明柔毛淫羊藿具有較強的區域適應能力和進化潛力。

遺傳結構就是遺傳變異或者說基因和基因型在時間和空間上的分布式樣，是一個物種最基本的特征之一，它受突變、基因流、選擇和遺傳漂變的共同作用，同時還和物種的進化歷史和生物學特性有關[19]。Hamrick等[20]研究結果表明，植物類群的分類地位、習性、交配系統、種子擴散機制、分布地區和演替階段對居群遺傳分化程度都有顯著的影響。而其中交配系統（遠交或近交所占比例）、分布范圍和生活型對居群遺傳結構的影響最大[21]。近交，不管是自交還是血緣相近個體間的交配，均會增加結合配子之間的一致性，降低重組從而導致家系內的個體更加一致，家系間出現遺傳分化。本研究顯示柔毛淫羊藿基因流Nm 0354 4，說明居群間基因交流很少。基因分化系數Gst 0585 2，各居群間存在較大的遺傳分化，是Hamrick等[20]得出的平均值0228 0的2倍多，其原因可能有以下幾點：柔毛淫羊藿自交率高。Suzuki[22]對日本淫羊藿屬植物的研究表明：淫羊藿為可兼性自花授粉的蟲媒花，共有2種類型的傳粉者，一類是一些專門采集花粉的小蜂；另一類主要是吸取花蜜為食的中等大小或體型更大些的蜂類，前者光顧所有的花朵，而后者是選擇性的光顧。采集花粉型的蜜峰對淫羊藿屬種內的基因流起了重要的作用，而吸取花蜜型的蜂類通過它們有選擇的授粉則加強了淫羊藿屬各種間的分化。這些傳粉者經常拜訪同一花序或同一植株不同花序的多個花朵然后才轉移到另一植株上，通常是同株授粉，即自交率高，自交會導致居群間的遺傳分化；柔毛淫羊藿種子散布范圍小。淫羊藿以種子繁殖為主，結實率中等，種子散布主要靠自然散落、螞蟻搬運，偶然情況下的水流搬運，淫羊藿屬植物的種子具有白色附屬物，被認為這更可能是蟻播植物的特點[23]。在植物中，基因流是通過花粉和種子擴散實現的，柔毛淫羊藿從花粉和種子散布上都范圍小，因此導致居群之間的遺傳分化顯著；本文的研究對象基本覆蓋了柔毛淫羊藿分布的主要區域，除了SCQCS，SCCZ和SCHY，SCYA居群間直線地理距離較近外，其他個居群間都相距較遠，皆超過50 km，地理間隔較遠。綜上所述各種因素阻礙了基因交流，最終導致了居群間較高的遺傳分化。

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[責任編輯呂冬梅]endprint