不同酸劑誘導人工沉香的分析與評價

周欣 陳麗燕 陳曉東 鐘兆健

[摘要]該研究按照《中國藥典》（2015年版）要求測定樣品醇溶性浸出物含量，同時建立GCMS指紋圖譜，使用《中藥指紋圖譜相似度評價（2012年版）》計算指紋圖譜相似度，峰面積歸一化法計算170～270 min與0～100 min 2區間總峰面積的比值，自動質譜退卷積定性系統（AMDIS）結合保留指數（RI）鑒定共有組分和差異組分，OPLSDA結合相關系數P（corr）和變量權重（VIP）篩選差異組分，灰色關聯度和TOPSIS分析法綜合評價人工沉香品質。結果顯示18批人工沉香中15批浸出物含量符合要求，指紋圖譜相似度在0439～0779，2區間總峰面積比值在0307～13254，共鑒定出9個共有組分和8個差異組分，綜合上述20個指標進行灰色關聯度和TOPSIS分析得到2%水楊酸誘導的人工沉香品質最優。建立的灰色關聯度結合TOPSIS分析法可快速判斷不同酸性誘導劑生產的人工沉香品質，為人工沉香的全面質量評價提供參考依據。

[關鍵詞]人工沉香； 酸性誘導劑； 氣相質譜； 灰色關聯度； TOPSIS

Analysis and evaluation of chemically induced artificial agarwood

ZHOU Xin1， CHEN Liyan 1， CHEN Xiaodong1，3， ZHONG Zhaojian1，

LI Haohua2， ZHANG Weimin2*， GAO Xiaoxia1*

（1. School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China；

2. State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China， Guangdong Provincial Key Laboratory of

Microbial Culture Collection and Application， Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology， Guangdong Institute of Microbiology， Guangzhou 510070， China；

3. Sirio Pharm Co.， Ltd.， Shantou 515041， China）

[Abstract]In this study，the content of ethanol extraction of agarwood were performed following the method of Chinese Pharmacopoeia（ChP 2015 edition） The chromatographic fingerprints were established by GCMS Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of traditional Chinese medicine（TCM）（version 2012） was employed to calculate the similarity of each chromatogram of agarwood The ratios of sum peak area in the range of 170270 min and 0100 min of individual chromatogram were calculated using square peaks to normalization AMDIS and RI were employed to identify the common and different peaks Correlation coefficient P（corr） combined with Variable important in projection（VIP） value was employed to screen the different representative components based on OPLSDA analysis Grey related degree and TOPSIS were used to evaluate the quality of artificial agarwoods The results showed that more than 100% of the ethanol extract content was found in 15 batches of artificial agarwoods among the total 18 The similarity of 18 batches artificial agarwoods was 04390779 The peak area ratios of two intervals were in the range of 030713254 The 9 common components and 8 different components were identified Meanwhile， 2% salicylic acid is the best inducer based on grey related degree and TOPSIS Grey related degree and TOPSIS can be used to evaluate the quality of artificial agarwoods rapidly These results provide a reference data to evaluate the qualityof artificial agarwoodendprint

[Key words]artificial agarwood； acid inducer； GCMS； grey related degree； TOPSIS

《中國藥典》（2015年版）收載的沉香Aqilariae Ligum Resinatum為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour） Gilg含樹脂的木材[1]。作為“十大廣藥”之一的沉香藥用價值高，亦可用于制造香精油和高檔香水[2]，也是極具價值的收藏品。白木香是我國生產沉香的唯一正品植物來源，現已被列為國家珍稀瀕危二級保護植物，并載入《中國植物紅皮書》[3]。

白木香是典型傷害誘導型植物，健康的白木香樹是不產沉香的，只有受到外界傷害時才會誘導白木香樹防御性反應從而產生沉香[4]。與健康的白木香相比，沉香化學組成主要是倍半萜類、2（2苯乙基）色酮類衍生物和芳香族類物質[5]，其獨特的香氣主要來源于倍半萜類化合物。白木香天然結香產量低、需時長，使得沉香長期處于供不應求的狀況，為滿足市場需求，人們嘗試采用多樣的人工誘導方式生產沉香。于是砍傷法、鑿洞法、鉆孔灼燒法等物理傷害誘導法；注射硫酸、甲酸等化學傷害誘導法；接菌法等生物誘導法相繼問世[67]。不同人工誘導方法所形成的沉香化學組成差異顯著，林峰等[8]采用GCMS分析出3種物理結香法（打釘法、砍傷法和鑿洞法）所產沉香均是以倍半萜、芳香族化合物及脂肪酸為主，認為刀砍物理法更接近天然結香方法；陳曉穎等[9]發現人工誘導沉香的2（2苯乙基）色酮類化合物種類較多、含量較高，其中化學試劑刺激法更具有優勢；雷胄熙等[10]分析以生物誘導結香技術所產人工沉香可檢出大量倍半萜類成分及芐基丙酮，并無檢出2（2苯乙基）色酮類成分，而色酮類成分主要為1（芐氧基）8萘酚，表明生物誘導法與傳統結香法在結香機制上可能存在差異。

目前，灰色關聯度和TOPSIS分析法是應用較廣的決策評判方法，灰色關聯度分析是構建一個理想參考數列，通過對不同樣品和理想品種的關聯度進行排序，關聯度越大的樣品與理想品種越接近，品質越好；TOPSIS分析法則是借助每個樣品的各個指標轉化為可比較的規范指標，然后比較每個樣品的綜合性狀與理想狀態的接近程度，越接近則表現越好[1113]。本文采用化學傷害誘導法進行人工誘導，以不同酸劑作為誘導劑[14]，生產的人工沉香按照《中國藥典》（2015年版）規定測定醇溶性浸出物含量，并以天然沉香為參比物構建GCMS指紋圖譜，應用灰色關聯度和TOPSIS分析法對人工沉香進行綜合分析，為酸劑誘導的人工沉香藥材的全面質量評價提供參考依據。

1材料

11人工造香試驗和樣品收集

天然沉香10批（1～10號）由廣東省信宜市珍稀沉香發展有限公司提供（來源及收集時間見表1），并由廣東藥科大學中藥學院藥用植物教研室嚴寒靜教授鑒定為瑞香科植物白木香A sinensis含有樹脂的木材，通過經驗鑒別、性狀鑒別、理化鑒別以及醇溶性浸出物含量測定和GCMS結合多元統計分析，鑒定為天然沉香[5] 。

人工沉香18批（11～28號）按王磊等[15]專利方法，選取6年生的健康白木香進行誘導試驗，白木香樹經嚴寒靜教授鑒定為A sinensis。人工造香12個月后，砍伐樹干，人工割取含樹脂的心材，陰干，制成人工沉香。樣品誘導方法、時長、采集時間等詳見表1。

12儀器和試劑

GCMS QP 2010 E氣相色譜質譜聯用儀（日本島津公司），Rtx5 MS毛細管柱025 μm×025 mm×30 m），BS124S電子分析天平（德國Sartorius），HH6數顯電子恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華儀器廠）。

水楊酸購于Aladdin公司（純度大于995%），乙烯利購于Aladdin公司（純度大于900%），C7～C40正構烷烴（編號DRH008SR2，美國AccuStandard公司，三氯甲烷中500 mg·L-1），三氯甲烷（AR，廣州化學試劑廠）。

2方法

21醇溶性浸出物的測定

按《中國藥典》（2015年版）一部中沉香[1]醇溶性浸出物測定法進行測定。

22GCMS指紋圖譜的建立

221供試品溶液的制備本品粉碎成細粉（4號篩），取細粉約05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷10 mL，密塞，搖勻，稱定質量，冷浸過夜。再稱定質量，用三氯甲烷補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液。置70 ℃水浴上蒸干，殘渣加三氯甲烷使溶解并轉移至1 mL量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，用045 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

222色譜及質譜條件色譜條件采用Rtx5 MS毛細管色譜柱（025 μm×025 mm ×30 m），進樣口溫度260 ℃，載氣為高純氦氣，程序升溫（初始溫度90 ℃保持4 min，以25 ℃·min-1升至160 ℃，保持5 min，再以03 ℃·min-1升至180 ℃，保持5 min，然后以2 ℃·min-1升至200 ℃，最后以1 ℃·min-1升至230 ℃，保持120 min），流速10 mL·min-1；分流比1/30，進樣量為1 μL。

質譜條件電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV，電離電壓1 kV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，溶劑延時5 min，質量掃描范圍m/z 50～500。

223方法學考察精密度試驗：取11號樣品1份，按221項制備供試品溶液，按222項色譜及質譜條件進行GCMS分析，連續進樣6次，《中藥指紋圖譜相似度評價（2012130723版本）》計算相似度均大于0993，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取11號樣品6份，分別按221項制備供試品溶液，按222項色譜及質譜條件進行GCMS分析，《中藥指紋圖譜相似度評價（2012130723版本）》計算相似度均大于0992，表明方法重復性良好。endprint

穩定性試驗：取上述同一供試品溶液，分別在0，5，10，15，20 h，按221項色譜及質譜條件進行GCMS分析，《中藥指紋圖譜相似度評價（2012130723版本）》計算相似度均大于0992，表明供試品溶液在20 h內穩定。

224樣品測定對28批沉香樣本每批取3份進行測定，取相似度均在0990以上的3個譜圖中的1個代表該沉香樣本的圖譜進行分析。

23數據處理

應用《中藥指紋圖譜相似度評價（2012年版）》軟件處理樣品總離子流圖，分別構建天然沉香指紋圖譜，并以天然沉香生成的對照圖譜作為參考圖譜，分析人工沉香指紋圖譜。

自動質譜退卷積定性系統（automated mass spectral deconvolution and identification system，AMDIS）處理樣品的總離子流圖，去除噪音和圖譜重疊的干擾[1618]，結合NIST05數據庫標準質譜信息比對和保留指數（retention indices，RI）校正進行共有組分和差異組分的鑒定。Rgui（310）環境下，XCMS數據包對GCMS數據文件進行反褶積和對齊，以全譜碎片信息為變量導入SIMCAP 120軟件中進行全譜碎片信息的有監督模式識別正交偏最小二乘法分析（OPLSDA）。

醇溶性浸出物含量、指紋圖譜相似度、2區間峰面積比值、9組共有成分和8組差異成分相對峰面積，共20個指標進行灰色關聯度和TOPSIS分析，尋找到與理想樣品最接近的誘導方法；并根據歸一化后的原始數據矩陣，確定出不同酸性誘導劑的最佳方案和最差方案，通過求出各被評方案與最佳方案和最差方案之間的距離，最終尋找到最優的酸劑誘導方式。

3結果與分析

31浸出物含量

28批沉香浸出物含量結果見表1，除3批人工沉香外，均符合《中國藥典》（2015年版）要求。10批天然沉香的浸出物含量均在100%以上；18批人工沉香中，僅4%水楊酸和4%乙烯利誘導的3批人工沉香浸出物含量低于100%，其余15批浸出物均符合要求。

32GCMS指紋圖譜相似度與2區間總峰面積比值分析以及共有組分鑒定

經多點校正后自動匹配，得到10批天然沉香的指紋圖譜，見表2，圖1A（圖中S1～S10與表1中N1～N10相對應），相似度在0821～0888，見表1；以10批天然沉香生成的對照圖譜作為參考圖譜分析18批人工沉香的指紋圖譜，相似度在0439～0779，見圖1B，表1；圖1C為人工沉香共有峰。

AMDIS結合NIST05數據庫和RI鑒定18批人工沉香共有組分，包括倍半萜類3個，色酮類3個和其他類3個，見表2。

前期工作中發現，170～270 min 的總峰面積[主要代表化合物為2（2苯乙基）色酮類]與0～100 min 的總峰面積（主要代表化合物為倍半萜類）的比值[5]可作為判斷沉香質量的評價依據，即是說沉香GCMS總離子流圖的表觀豐度可作為評價沉香質量的指標之一[19]，本文中10批天然沉香2區間峰面積比值均小于1，18批人工沉香的比值在0307～13254，見表1。

33差異組分的鑒定

在Rgui環境下應用XCMS數據包提取10批天然沉香和18批人工沉香的三維數據矩陣，包括樣本名稱、離子強度和碎片信息（保留時間質荷比），對數據矩陣進行歸一化處理后導入SIMCAP 120軟件進行OPLSDA判別分析，28批樣品被分為3大類，天然沉香為第一類（組1），人工沉香分為2類（組2和組3）。在建立的OPLSDA模型中，在變量X上的總貢獻率為838%（R2X=0838），在變量Y上的總貢獻率為835%（R2Y=0835），同時交叉驗證預測能力為691%[Q2（cum）=0691]，見圖2。

由相關系數P（corr）結合變量權重（VIP）值的評價方法來篩選出對OPLSDA分組有貢獻的差異組分。P（corr）用于解釋各組分對樣品分類的貢獻大小，VIP>1時變量具有統計學意義。本文選擇P（corr）大于08且VIP值大于15的變量為顯著性差異組分，共篩選出8個差異組分，鑒定結果見表3。

34灰色關聯度分析

灰色關聯度中對不同酸劑誘導的18批人工沉香的浸出物含量、指紋圖譜相似度、2區間總峰面積比值、9個共有組分和8個差異組分的相對峰面積，共20個指標進行分析，各指標的具體數據見表4。

341理想樣品的選擇在18個不同酸劑誘導的人工沉香樣品中選出各項指標的最優值作為理想樣品X，其對應的理想數值按照表4的順序依次為：3240，0799，078，1325，252，429，683，1023，409，3631，465，831，014，1023，245，907，2130，465，348，442。

342兩級最大差和最小差以選出的理想樣品指標為基準，根據公式計算人工沉香樣品與理想樣品序列間的絕對差別，從中得到最大差和最小差分別為3625和0。

minni=1minni=1|x（k）-xi（k）|

maxni=1maxni=1|x（k）-xi（k）|

343關聯系數和關聯度計算關聯系數反應的是各指標與理想值的吻合程度，關聯系數越大表明與理想值越接近，計算公式如下。

35TOPSIS分析

351歸一化處理上述醇溶性浸出物含量、指紋圖譜相似度、2區間總峰面積比值、9組共有組分和8組差異成分，代表了人工沉香成分的主要信息見

4討論

本文中28批樣品浸出物含量基本符合《中國藥典》（2015年版）要求；10批天然沉香指紋圖譜相似度較高，而18批人工沉香相較天然沉香的相似度偏低且差異較大；同時從指紋圖譜的表觀豐度來判

斷天然沉香2區間總峰面積比值均小于1，而人工沉香的比值則跨度較大，在0307～13254；指紋圖譜技術結合多元統計分析，快速篩選出酸性誘導劑生產的人工沉香主要化學組成為白木香醛（baimuxinal，A3）、2（2苯乙基）色酮[2（2phenylethyl）chromone，A7]、絨白乳菇醛（velleral，B2）等沉香特征性成分。endprint

研究表明，水楊酸可促進植物的生長發育，增強植株的防御性反應和抗脅迫能力，提高了植物的產量和營養，同時對植物連作障礙造成的脅迫亦具有一定的積極作用[20]，乙烯利作為外源植物生長調節物質，在農作物生產中也有廣泛應用[21]；因此實驗選用不同濃度的兩種酸劑進行化學誘導，通過綜合浸出物含量、指紋圖譜相似度、2區間峰面積比值以及9個共有組分和8個差異組分，共20個指標進行灰色關聯度和TOPSIS分析，期望優選出最佳的誘導劑，結果顯示，盡管排序有差異，但2種分析手段得到F5，F6，F8，F9，G1，G3，H1 7個樣品的排名都靠前，其中F5，F6，F8，F9均由2%水楊酸誘導，G1和G3分別由2%和4%乙烯利誘導，盡管G3排名較靠前，但是其浸出物結果卻未達到藥典要求，H1采用混合誘導劑，操作相對較繁瑣。因此分析結果得出，5個采用2%水楊酸誘導的樣品綜合排名較前，品質較優。

本文通過對白木香木質部注入適量的酸性誘導劑進行化學傷害誘導，可產生沉香樹脂，該方法操作簡便快速、成本低廉，適用于大規模推廣應用。

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[責任編輯丁廣治]endprint