栽培遠志中次級代謝物含量變化的影響因素分析

蒲雅潔1，2， 王丹丹1，2， 閆艷1， 田洪嶺3， 彭冰4*， 秦雪梅1，

馬存根5， 杜晨暉5， 胡本祥6， 張福生1*

[摘要]產地與生長年限均為栽培中藥中次級代謝物含量變化的主要影響因素。該研究通過建立超高效液相色譜四級桿飛行時間質譜及采用多元統計的方法，分析生長年限與產地對栽培遠志中次級代謝物含量變化的影響。結果顯示：①產地因素對栽培遠志中次級代謝物含量變化的影響大于生長年限；②蔗糖酯類和低聚糖酯類受產地因素影響較大，tenuifoliside B與tenuifoliside C在安國遠志中含量較高，3，6′disinapoyl sucrose， tenuifoliose S， tenuifoliose L及tenuifoliose V則在汾陽遠志中含量較高；③產地與生長年限均不是口山酮類成分含量變化的主導因素；④皂苷類成分受生長年限的因素影響較大，多數皂苷類次級代謝物含量隨著生長年限延長有升高趨勢。栽培遠志中不同次級代謝物受產地與生長年限影響的程度不完全相同，本研究有助于栽培遠志的良種選育及遠志藥材商品規格等級標準的修訂。

[關鍵詞]栽培遠志； UPLCQTOF MS； 代謝組學； 產地； 生長年限

Analysis of influencing factors of secondary metabolites

contents in cultivated Polygala tenuifolia

PU Yajie1，2， WANG Dandan1，2， YAN Yan1， TIAN Hongling3， PENG Bing4*，

QIN Xuemei1， MA Cungen5， DU Chenhui5， HU Benxiang6， ZHANG Fusheng1*

（1 Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；

2 College of Chemistry and Chemical Engineering， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；

3 Institute of Industrial Crop， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Fenyang 032200， China；

4 Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine， Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to

Capital Medical University， Beijing 100010， China；

5 Shanxi University of Chinese Medicine， Taiyuan 030024， China；

6 Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China）

[Abstract]This work was launched to explore the effect of habitat and growth year on the secondary metabolites contents of cultivated Polygala tenuifolia The samples of cultivated P tenuifolia were analyzed by ultrahigh performance liquid chromatography（UPLC）quadrupole timeofflight mass spectrometry（QTOF MS）， and the obtained data were analyzed using multiple statistical analysis and cluster analysis The results showed that compared with growth year， habitat is a main influencing factor which affected the secondary metabolites contents of P tenuifolia The contents of sucrose esters and oligosacchride multiesters are greatly dependent on the habitat （the sampleAG with high levels of components of tenuifoliside B and tenuifoliside C， and the sampleFY with high levels of 3，6′disinapoyl sucrose， tenuifoliose S， tenuifoliose L， and tenuifoliose V） There is no obvious effect of habitat and growth year on xanthone The contents of triterpene saponins are greatly dependent on the growth year， and the content of parts of triterpene saponins increased as time goes onThe result indicated that the effect of habitat and growth year on different types of secondary metabolites is not completely equivalent This study will contribute to the breeding of P tenuifolia and amendment of current commodity criteriaendprint

[Key words]cultivated Polygala tenuifolia； UPLCQTOF MS； metabolomics； habitats； growth year

遠志為遠志科植物遠志Polygala tenuifolia Willd或卵葉遠志P sibirica L的干燥根，是我國常用的大宗中藥材之一，臨床上具有安神益智、交通心腎、祛痰、消腫等功效[1]；作為多年生草本植物，其廣泛分布于我國的東北、華北、西北、華中以及四川等地[2]。因遠志的野生資源相對匱乏，目前商品遠志藥材主要以栽培品為主，其中山西產栽培遠志占全國總銷售量的50%以上[3]，而河北、陜西、山東等地也有遠志藥材銷售；此外，不同產地商品遠志藥材生長年限長短不一，二～三年生的遠志藥材均可做商品銷售。由于產地和生長年限是影響藥材中次級代謝產物（藥材的主要有效成分）積累變化的主要因素，而次級代謝物含量的高低又可間接反映藥材的質量[4]。因此，為了更好地控制商品遠志藥材的質量，研究產地與生長年限對栽培遠志中次級代謝物的影響就凸顯出其重要意義。

超高效液相色譜（UPLC）具有超高速度、超高分離度、超高靈敏度等特點，而飛行時間質譜（TOF MS）則可將UPLC分離到的物質進行精確的相對分子質量測定，能對不同的組分進行精確定性。可見，UPLCQTOF MS在成分極其復雜的中藥及復方藥物研究中具有明顯的優勢[5]。植物代謝組學主要研究外界因素變化對植物造成的影響[6]，而代謝物數量或種類的變化則被認為是外界環境對植物影響的最終響應[7]，因此用植物代謝組學來分析外界環境對中藥材的影響是十分必要的。本實驗采用UPLCQTOF MS代謝組學技術，以山西新絳（栽培遠志藥材的主產地之一）產栽培遠志藥材（一，二，三年生）為主要研究對象，并結合河北安國（一，二年生）、山西汾陽（一，三年生）產栽培遠志，分析產地和生長年限對栽培遠志藥材中次級代謝物含量變化的影響，該研究將有助于栽培遠志的良種選育和遠志藥材商品規格等級標準的修訂。

1材料

ACQUITY UPLC IClass/Xevo G2 Q TOF（Waters公司，USA）；超聲波清洗器（KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司）；低速離心機（SC3600，上海亞榮生化儀器廠）；高速臺式冷凍離心機（TGL16，長沙湘儀離心機儀器有限公司）；旋轉蒸發器（RE52A，安徽中科中佳儀器廠）。純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；乙腈（色譜純，Tedia，USA）；其余試劑均為分析純。

本實驗所用栽培遠志樣品分別采于山西省新絳縣北池村（XJ）、山西省汾陽市的山西省農科院經濟作物研究所實驗田（FY）、河北省安國市霍莊（AG）；采集各栽培遠志樣品，陰干，取根，經山西大學中醫藥現代研究中心的秦雪梅教授鑒定為遠志科植物遠志P tenuifolia的干燥根，留樣保存于山西大學中醫藥現代研究中心。樣品具體信息見表1。

從采集樣品中隨機抽取6～10株樣品，粉碎，過藥典3號篩，稱取粉末05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，加甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過。取續濾液，即得。所有樣品均平行備樣3份，每份進樣2針。

2方法

21色譜條件

色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（21 mm×55 mm，17 μm，美國Waters公司）。流動相：乙腈（A）和01%甲酸水（B）。梯度洗脫程序為 0～1 min，5% A；1～3 min，5%～12% A；3～6 min，12%～20% A；6～10 min，20%～30% A；10～105 min，30%～35% A；105～135 min，35%～45% A；135～15 min，45%～50% A；15～18 min，50%～95% A；18～19 min，95% A，流速 050 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量為2 μL[8]。

22質譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為ESI-模式。霧化氣體為高純度氮氣（N2），碰撞氣體為高純度氦氣（He），掃描范圍m/z 50～2 000，錐孔電壓為40 V，毛細管電壓為25 KV，離子源溫度為100 ℃，脫溶劑氣體溫度為500 ℃，脫溶劑氣體流速為800 L·h-1，錐孔氣體流量50 L·h-1，碰撞能量（CE）50～80 V，LockMass為亮氨酸腦啡肽，m/z 554261 5[8]。

23數據處理

檢索美國化學學會SciFinder數據庫，將文獻中有關遠志化合物的數據進行全面收集整理，共收集到59種化合物信息。對UPLCQTOF MS原始數據進行預處理，得到質譜矩陣數據（矩陣由Waters公司自帶軟件TransOmicsTM生成），每個樣品得3 614個變量，平行6份，共有7個樣品，得數據矩陣42×3 614，對其峰面積進行歸一化處理，并導入至SIMCAP 130（Umetrics，Ume，Sweden）軟件進行主成分分析（PCA），同時采用SPSS 16（IBM SPSS，USA）軟件依次對每一類次級代謝物進行聚類分析。次級代謝物的相對含量為其峰面積占總出峰面積的百分比，采用GraphPad Prism 50（USA）軟件繪制栽培遠志樣品中次級代謝物的相對含量圖。

3結果

31 栽培遠志樣品中次級代謝物的指認分析

本實驗建立UPLCQTOF MS方法，分析不同產地與生長年限下栽培遠志樣品中的次級代謝物。因遠志樣品在負離子模式下的離子化效果優于正離子模式，因此本實驗只采用電噴霧負離子模式檢測。通過質譜和光譜數據及前期整理的化合物信息，本實驗共推斷指認出36個次級代謝物，見圖1，2，表2，其中包括：6個蔗糖酯類（1～6），4個酮類（7～10），15個低聚糖酯類（11～25），11個三萜皂苷類（26～36）。見圖1。endprint

311蔗糖酯類本實驗共推斷指認出6個蔗糖酯類物質（1～6）。化合物1產生m/z 517156 7[M-H]-分子離子峰，失去1分子蔗糖（sucroce）產生阿魏酰基碎片離子m/z 175039 1（C10H8O3），繼而丟失CH3基團產生碎片離子m/z 160015 4。此外，化合物1失去324后產生碎片離子峰m/z 193048 6[ferulic acid-H]-。依據文獻[9]，推斷化合物1為阿魏酸與蔗糖成酯形成的sibiricose A5，見圖。其余蔗糖酯類化合物結構的推導同化合物1，結果見圖2，表2。

312酮類本實驗共推斷指認出4個酮類化合物（7～10），均以苷的形式存在。以化合物8為例，其在負離子模式下，產生m/z 537124 4[M-H]-分子離子峰，丟失1分子芹菜糖（132）產生碎片離子m/z 405082 6[M-H-Api]-，再丟失1分子H2O產生碎片離子m/z 387064 2[M-H-Api-H2O]-，繼而分別丟失中性碎片C3H6O3（90）和C4H8O4（120），產生碎片離子m/z 297039 8和m/z 267029 8，該特征為黃酮碳苷類化合物的裂解規律[12]，m/z 243028 1為化合物8丟失1分子芹菜糖（132）與1分子葡萄糖（162）而產生的苷元離子。依據文獻[9]，推斷化合物8為sibiricaxanthone A，見圖3。根據化合物7～10的裂解碎片，并參考文獻[9]，推斷這3個化合物也是黃酮碳苷類化合物，相應的化合物結構見圖2，表2。

313低聚糖酯類遠志中的低聚糖酯類（tenuifoliose A～P）具有共同的骨架結構，為葡萄糖（1→3）葡萄糖（1→3）葡萄糖（2→1）葡萄糖（1→1）果糖糖鏈與乙酰基、桂皮酰基類相結合[9]。本實驗共推斷指認出15個低聚糖酯類化合物11～25。化合物20產生m/z 1 337403 1[M-H]-分子離子峰，丟失阿魏酰基（C10H8O3）產生碎片離子m/z 1 161361 8，繼而丟失桂皮酰基（C9H6O2）產生碎片離子m/z 1 015305 5；m/z 1 161361 8丟失中性碎片C2H2O和C2H4O2產生碎片離子m/z 1 119342 5和m/z 1 101337 8，再分別丟失桂皮酰基產生碎片離子m/z 997301 5和m/z 979283 1；m/z 1 161361 8丟失1分子苯甲酸（122）產生碎片離子m/z 1 039317 5。結合文獻[910]，推斷化合物20為tenuifoliose B，見圖3。化合物11～19，21～25也表現出與化合物20類似的裂解行為，故參照化合物20的推導方法，推斷其相應的化學結構，結果見圖2，表2。

314三萜皂苷類遠志中的皂苷主要為齊墩果烷型的五環三萜類，其C3位連接1個葡萄糖，稱為A鏈，C28位為低聚糖酯鏈，稱為B鏈；遠志三萜皂苷間的結構差異，是由其C28所連接的糖類及酰基組的不同而造成[9]。本實驗共推斷指認出11個遠志皂苷（26～36）。化合物33產生m/z 1 761726 1[M-H]-分子離子峰，丟失3OH3CH3戊二酰基

基團（HMG，144）產生碎片離子m/z 1 617686 2，再依次脫去3，4，5三甲氧基桂皮酸（TMCA，220）、葡萄糖（Glu）、H2O、CO2、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、芹菜糖（Api）和2個鼠李糖（Rha），產生碎片離子m/z 455317 0，繼而再失去C27位的CH2O基團產生碎片離子m/z 425305 1。參考文獻[9]，推斷該化合物為onjisaponin V，見圖3。化合物26～32，34～36表現出與化合物33類似的裂解規律，結合文獻[911]，推斷它們相應的化學結構，結果見圖2，表2。

32栽培遠志樣品中次級代謝物含量變化的主要影響因素分析

PCA是代謝組學數據處理中最常用的一種無監督的模式識別方式[13]，因不對樣品進行任何人為干預，PCA模型能反映數據的原始狀態，可以總覽數據是否存在潛在規律或者分組情況[14]。不同產地、不同生長年限下栽培遠志的PCA散點圖，FY位于t[1]軸的左側，AG與XJ位于t[1]軸的右側，表明AG，XJ樣品與FY樣品可以明顯區分；AG位于t[2]軸的上部，XJ1，XJ2位于t[2]軸的下部，說明AG可與XJ1，XJ2明顯區分；另，XJ3位于t[2]軸的上部，與XJ1，XJ2明顯區分，而與AG1，AG2距離較近，表明XJ3體內的次生代謝物總含量更接近于AG，見圖4。上述結果表明，在產地與生長年限因素的共同影響下，栽培遠志中次級代謝物的變化受產地因素影響更大。

通過SPSS軟件（ward法）對UPLCQTOF MS推斷指認出的四類次級代謝物分別進行無監督的系統聚類分析，以明確每類次級代謝物含量變化分別受產地和生長年限因素影響的情況。圖4B為不同栽培遠志樣品中蔗糖酯類成分的聚類圖，當閾值為5時，遠志樣品被分為2類，即XJ與AG聚為一類，FY聚為一類；而當閾值為4時，XJ1，XJ2，XJ3聚為一類，AG1與AG2聚為一類，FY1與FY3聚為一類。圖4C為不同栽培遠志樣品中酮類成分的聚類圖，從圖中可看出產地和生長年限均不是促使遠志樣品進行分組的主導因素。圖4D為不同栽培遠志樣品中低聚糖酯類成分的聚類圖，在閾值為3時，遠志樣品被分為3類，AG1與AG2聚為一類，XJ1，XJ2，XJ3聚為一類，FY1與FY3聚為一類。圖4E為不同栽培遠志樣品中皂苷類成分的聚類圖，在閾值為6時，遠志樣品被分為2類，XJ2，XJ3，FY3聚為一類，XJ1，FY1，AG2和AG1聚為一類。以上結果表明，栽培遠志樣品中的蔗糖酯與低聚糖酯類成分較易受產地因素的影響，皂苷類成分則較易受生長年限因素的影響，而產地與生長年限均對酮類成分有影響，但均不為主導因素。

33栽培遠志樣品中次級代謝物相對含量的變化規律分析endprint

用GraphPad Prism 50軟件對次級代謝物的相對含量作圖，并與本課題組之前研究的陜西合陽產遠志（HY）的次級代謝物含量[8]進行比較，分析主要差異代謝物相對含量的變化規律。

栽培遠志中4類次級代謝物的相對含量柱狀圖，見圖5。圖5A為栽培遠志樣品中蔗糖酯類成分的相對含量，對于一年生的栽培遠志，AG，XJ，HY，FY4個產區蔗糖酯類成分的相對含量相近，以FY的略高；對于二年生的栽培遠志，與AG2相比，XJ2高于AG2，而HY2則低于AG2（P<0001）；對于三年生的栽培遠志，與FY3相比，XJ3高于FY3，而HY3則低于FY3。圖5B為栽培遠志樣品中酮類成分的相對含量，在一年生的栽培遠志中，AG1酮類成分的相對含量最低，HY1中的最高；在二年生的栽培遠志中，與AG2相比，HY2高于AG2，XJ2高于AG2（P<001）；在三年生的栽培遠志中，FY3中酮類成分的相對含量最高，與FY3相比，HY3與XJ3均低于FY3（P<0001），以HY3中酮類成分的相對含量最低。圖5C為栽培遠志樣品中低聚糖酯類成分的相對含量，AG1，AG2中低聚糖酯類成分明顯高于同一年限其余產地，其次為XJ1，XJ2。FY3中低聚糖酯類成分相對含量最低，HY3與XJ3均高于FY3（P<0001），以XJ3中最高。圖5D為栽培遠志樣品中皂苷類成分的相對含量圖，不同生長年限XJ遠志中皂苷類成分的相對含量均高于HY，隨著生長年限的延長，AG，HY，FY中皂苷的相對含量逐漸增多，以FY中皂苷類成分的增長最多。

其次，進一步對推斷指認出的各次級代謝物相對含量進行比較分析，見圖6。從化學成分分類的角度分析，蔗糖酯類代謝物中，以3，6′disinapoyl sucrose（4）與tenuifoliside A（5）的相對含量所占比例高，隨著生長年限的延長，不同產地3，6′disinapoyl sucrose的相對含量均升高，且對于同一年限遠志，3，6′disinapoyl sucrose的相對含量以FY>XJ>HY。而隨著生長年限的延長，不同產地tenuifoliside A的相對含量則有降低趨勢，但XJ降低的幅度小于其余產地，在二、三年生遠志中，均以HY中tenuifoliside A的相對含量最低。AG中tenuifoliside B（3）與tenuifoliside C（4）的相對含量最高。FY中sibiricose A6（2）的相對含量最低。

酮類代謝物，以sibiricaxanthone A（8）與polygalaxanthone Ⅲ（10）所占的相對含量比例高，且FY3中二者的相對含量最高。HY1中lancerin（7），7Omethylmangiferin（9）的相對含量較其余產地有優勢，但二者在HY3中的含量均降低，且均低于XJ3。

低聚糖酯類部分次級代謝物（11～19）隨著生長年限的延長，其相對含量逐漸升高。FY中低聚糖酯類次級代謝物的相對含量，較其余產地有明顯差異。tenuifoliose S（13），tenuifoliose L（16），tenuifoliose V（25）3個次級代謝物在不同年限的FY中均高于同年限的其余產地，而tenuifoliose F（15），tenuifoliose C（18），tenuifoliose B（20），tenuifoliose O（22），tenuifoliose A（23），tenuifoliose N（24）在不同年限的FY中，相對含量則均低于同年限的其余產地。

皂苷類次級代謝物中，以polygalasaponin ⅩⅩⅧ（27），onjisaponin L（29），senegin Ⅲ（32），onjisaponin Ⅴ（33），onjisaponin Fg（35）的相對含量比例高。AG中polygalasaponin ⅩⅩⅫ（26），onjisaponin Ⅴ（33），onjisaponin Fg（35）的相對含量高于同一年限的其余產地，FY中onjisaponin L（29），senegin Ⅲ（32）的相對含量較其余產地高。與HY3，FY3相比，XJ3中polygalasaponin ⅩⅩⅫ（26），onjisaponin Ug（30），onjisaponin Sg（31），onjisaponin Ⅴ（33），onjisaponin F（34），onjisaponin Fg（35）的相對含量較高。onjisaponin L（29）在不同生長年限下，相對含量的變化差異不大。而次級代謝物polygalasaponin ⅩⅩⅧ（27），onjisaponin Ug（30），onjisaponin Ⅴ（33），onjisaponin Fg（35），onjisaponin TH（36）隨生長時間的延長，有逐漸升高的趨勢。

4討論

次級代謝物是中藥材發揮藥效的主要成分，遠志中的四類次級代謝物均表現出一定的藥理活性。糖酯類次級代謝物（蔗糖酯類、低聚糖酯類）具有改

善認知、腦保護、抗抑郁等作用[1518]。酮類次級代謝物具有止痛、抗菌、抗凝血等活性[15]。皂苷類次級代謝物可通過膽堿能效應[19]、抗神經細胞凋亡及抗氧化活性[20]、抗Aβ神經毒性[21]、改善海馬區齒狀回的長時效增強效應[22]、阻遏炎癥信號通路減輕脾切除術后認知障礙[23]等機制，發揮抗癡呆、改善記憶障礙及腦保護等藥理作用[24]。

鑒于次級代謝物的藥理活性，其含量的高低決定遠志的臨床療效。因此，本文采用UPLCQTOF MS代謝組學技術分析產地與生長年限2個因素對栽培遠志中次級代謝物含量變化的影響，發現：產地因素對次級代謝物的影響大于生長年限；蔗糖酯類與低聚糖酯類受產地因素影響較大；產地與生長年限均對酮類有影響，但影響不顯著；而皂苷類成分受生長年限影響較大，多數皂苷類次級代謝物含量隨著生長年限延長有升高趨勢。endprint

41遠志藥材在良種選育過程中應充分考慮種質的產地因素

不同產地遠志藥材次級代謝物含量的差異決定了藥材品質的差異，在遠志的主產區中，安國遠志中低聚糖酯類成分的相對含量較高，但酮類成分相對含量較低；合陽遠志中4類次級代謝物的相對含量均沒有明顯優勢；新絳遠志的蔗糖酯類成分、皂苷類成分的相對含量較高；汾陽遠志的蔗糖酯類、酮類的相對含量高，而低聚糖酯類成分則含量較低。滕紅梅等[25]對不同主產區遠志藥材中的遠志皂苷元及多糖含量進行檢測，認為聞喜、新絳遠志中二者的含量處于較高水平，與本文結果一致。因此，遠志藥材在良種選育過程中，應充分考慮產地因素。

42修訂遠志藥材商品規格等級標準時應考慮生長年限因素

生長年限作為影響栽培遠志中次級代謝物含量變化的因素之一，主要影響皂苷類物質的含量，薛英等[8]發現，遠志皂苷中的主要大類成分會隨著生長年限的延長含量逐漸增加，與本文結果一致。滕紅梅等[26]對不同生長年限栽培遠志的產量及遠志總皂苷元含量進行分析，認為三年生栽培遠志中遠志總皂苷元的含量最高。因此，在今后修訂遠志藥材商品規格等級標準時，應充分考慮生長年限因素，做到更合理的等級劃分。

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[責任編輯丁廣治]endprint