芪藥消渴膠囊質量標準研究

張國躍

（陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710065）

·檢驗檢測·

芪藥消渴膠囊質量標準研究

張國躍

（陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710065）

目的 建立芪藥消渴膠囊的質量控制方法。方法 采用薄層色譜（TLC）法對制劑中的黃芪、葛根、知母進行定性。采用反相高效液相色譜（RP－HPLC）法對制劑中的西洋參進行定量，色譜柱為Ultimate C18柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，流動相為乙腈－0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，流速為1.0 mL／min，柱溫為40℃，檢測波長為203 nm。結果 TLC法定性斑點清晰，分離度好。RP－HPLC法測定Rg1，Re和Rb1對照品進樣量分別在0.985 9～14.788 5 mg，0.411 6～4.939 2 mg和0.132 3～1.984 5 mg范圍內與峰面積線性關系良好，回收率分別為95.19%，97.84%，103.65%，RSD分別為2.29%，2.97%，3.87%（n＝6）。結論 該定性、定量方法操作簡便、準確、重復性好，可有效地控制該產品質量。

芪藥消渴膠囊；黃芪；葛根；知母；西洋參；薄層色譜法；反相高效液相色譜法

芪藥消渴膠囊由西洋參、黃芪、知母、五味子、五倍子、葛根等12味中藥組方，具有滋腎養陰、益氣生津的功效，臨床常用于2型糖尿病的輔助治療。原質量標準收載于國家食品藥品監督管理局標準YBZ25672005中，檢驗項目較少，不能全面控制產品質量。受陜西康惠制藥股份有限公司的委托，按照國家藥典委員會關于藥品質量標準技術要求和對該品種補充資料通知[國藥典中行字（2014）補329號）]的要求，對“芪藥消渴膠囊”原質量標準中的【性狀】項、【鑒別】項、【浸出物】項及【檢查】項“人參”的薄層色譜檢查方法，進行了全面修訂和驗證，建立了西洋參的含量測定方法，并進行了方法學驗證，最終確定了黃芪、葛根、知母、西洋參、山藥和枸杞子的定性、人參的檢查及西洋參的定量方法。本研究中介紹了黃芪、葛根、知母的薄層色譜（TLC）定性法和測定西洋參中人參皂苷Rb1，Re，Rg1含量的反相高效液相色譜（RP－HPLC）法。本次修訂的質量標準定性方法簡便易行、準確可靠、重復性好，可全面、有效地控制該產品質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LG－30AD型高效液相色譜儀（紫外檢測器，日本島津公司）；LG－20AD型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，日本島津公司）；Waters Empower工作站（美國Waters公司）；色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料(Kromasil公司，250 mm×4.6 mm，5 μm；Ultimate公司，250 mm×4.6 mm，5 μm)；SartoriusAGME235S型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；UV2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；KQ－500DE型數控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

芪藥消渴膠囊樣品，西洋參藥材，黃芪、葛根、知母、西洋參等陰性樣品均由陜西康惠制藥股份有限公司提供；葛根（批號為 1175－200001）、知母（批號為121070－201105）、西洋參（批號為120997－200608）對照藥材，黃芪甲苷（批號為110781－200512）、葛根素（批號為110752－200511）、菝葜皂苷元（批號為110744－200509）、人參皂苷 Rg1（批號為 110703－201027）、Re（批號為 110754－201324，）和 Rb1（批號為 110704－201223）對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供；試驗用化學試劑為分析純，試驗用水為純化水和超純水，甲醇、乙腈為色譜純。預制板(青島海洋化工廠分廠)；薄層板(青島海洋化工有限公司)，自行鋪制。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別[1－3]

黃芪：取樣品膠囊，傾出內容物，精密稱取4 g，放入濾紙卷內并置索氏提取器內，加入乙醚，水浴回流2 h，乙醚液棄去，揮去藥渣的乙醚，再加入甲醇，水浴回流提取至無色，取甲醇液蒸干，殘渣用水20 mL使其溶解，分次轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取5次（25，20，20，20，15 mL），合并正丁醇液，再用氨試液洗滌2次，每次15 mL，棄去氨試液，把正丁醇蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含黃芪的陰性樣品4 g，精密稱定，用相同方法制成黃芪陰性對照溶液。再取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成1 g／L的溶液，作為對照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別交叉點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（65∶35∶10，在10℃以下放置12 h使分層，取下層溶液）為展開劑，展開，取出，晾干，薄層板上噴10%硫酸乙醇溶液，用熱風吹至斑點顯色，在日光下和紫外光燈(365 nm)下觀察。結果斑點在日光下和紫外光燈(365 nm)下均顯色清晰，分離效果較好，Rf值適中，陰性對照無干擾，專屬性好。詳見圖1A和圖1B。

葛根：取樣品膠囊傾出內容物，精密稱取4 g，加入20 mL甲醇，超聲處理10 min，將甲醇用濾紙過濾，濾液蒸干，殘渣加5 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。取不含葛根的陰性樣品4 g，用相同方法制成葛根陰性對照溶液。另取葛根素對照品，加甲醇制成0.5 mg／mL的溶液，作為對照品溶液。再取葛根對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水（15∶40∶22∶10，10℃以下放置12 h使分層，取下層溶液）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈(365 nm)下觀察。結果斑點無擴散，Rf值合適，分離效果尚好，陰性對照無干擾[3]。詳見圖1 C。

知母：取樣品膠囊傾出內容物，精密稱取4 g，加50 mL 75%乙醇溶液，加熱回流40 min，濾過，濾液加鹽酸2 mL，回流水解2 h，濾過，濾液濃縮至約10 mL，用二氯甲烷40 mL分2次提取，合并二氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，移入中性氧化鋁柱（100～200目，4 g，內徑15 mm）中，以甲醇為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液約80 mL，水浴蒸干，殘渣加1 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。同法制成知母陰性對照溶液。另取菝葜皂苷元，加甲醇制成1 g／L的溶液，作為對照品溶液。再取知母對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述4種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－丙酮（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，薄層板噴磷鉬酸試液，在105℃小心加熱，至斑點顯色清晰。結果斑點分離較好，Rf值適宜，陰性對照基本無干擾[4－5]。詳見圖1 D。

圖1 薄層色譜鑒別圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：A為乙腈，B為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，見表1；流速：1.0 mL／min；檢測波長：203 nm；柱溫：40℃。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：分別稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷 Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇使其溶解，制成混合對照品溶液，每1 mL含人參皂苷Rg10.1 mg，人參皂昔Re 0.4 mg，人參皂苷Rb11 mg，即得。

供試品溶液：取膠囊內容物，混合均勻，研細，取約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50 mL，稱定質量，置水浴中加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定質量，用水飽和正丁醇補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取續濾液25 mL，置蒸發皿中，蒸干，殘渣加50%甲醇適量使溶解，轉移至10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 方法學考察

檢測波長確定：取人參皂苷 Rg1對照品溶液（約0.13 g／L），在200～350 nm波長處進行紫外光譜掃描，結果人參皂苷Rg1對照品溶液的最大吸收波長在203 nm，與文獻[1，6]的研究結果類似，故選擇203 nm作為檢測波長。

專屬性試驗：取不含西洋參的陰性樣品，依法制備陰性對照品溶液，取適量注入高效液相色譜儀，測定，再與混合對照品溶液和供試品溶液比較。結果西洋參陰性對照在混合對照品溶液保留相同時間處未出現色譜峰，表明陰性對照品溶液對此方法無干擾，專屬性強。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關系考察：分別依法進樣量1，2，3，4，5，10，15 μL人參皂苷混合對照品溶液，測定。以進樣量(X)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程人參皂苷Rb1：Y＝3×10－6X－0.102（r＝0.999 6），人參皂苷Re：Y＝4×10－6X－0.085（r＝0.999 8），人參皂苷Rg1：Y＝5×10－6X－0.032（r＝0.997）。結果表明，3種對照品溶液的進樣量分別在0.985 9～14.788 5 mg、0.411 6～4.939 2 mg、0.132 3～1.984 5 mg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：重復取上述對混合照品溶液7次，進樣測定。結果峰面積的 RSD分別為0.37%，1.38%，1.13%(n＝7)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一份樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，9，24，37 h時進樣測定，結果表明，供試品溶液在37 h內穩定性較好。

重復性試驗：精密稱取同一樣品共6份，依法制備供試品溶液，進樣測定。結果人參皂苷Rb1平均含量為7.744 1 mg／g，RSD＝2.18%(n＝6)；人參皂苷Re平均含量為6.466 0 mg／g，RSD＝1.76%(n＝6)；人參皂苷Rg1平均含量為0.986 1 mg／g，RSD＝2.67%(n＝6)；3種人參皂苷總量為15.196 2 mg／g。表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：分別精密量取含3種人參皂苷的對照品混合溶液1 mL，置具塞錐形瓶中，揮干溶劑，再精密稱取樣品約0.5 g，共6份，依法制備供試品溶液，進樣測定，結果見表2。

光譜掃描與峰純度檢測：取供試品溶液與人參皂苷Rb1，Re，Rg1混合對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測定，用二極管陣列檢測器，掃描190～400 nm波長的PDA光譜并觀察峰的純度。結果供試品溶液的高效液相色譜圖中分別呈現與人參皂苷Rb1，Re，rRg1對照品溶液色譜峰保留時間相同的色譜峰，PDA光譜與上述對照品溶液的PDA光譜相同，樣品的峰純度符合要求。

2.2.4 樣品含量測定

按上述供試品溶液制備方法制備溶液，測定10批樣品中3種人參皂苷含量的總量，結果總量為12.059 4～15.989 1 mg／g，平均含量為14.597 8 mg／g。詳見表3。

表2 人參皂苷加樣回收試驗結果（n＝6）

表3 樣品含量測定結果（mg／g，n＝4）

3 討論

根據3批西洋參藥材、10批樣品中3種人參皂苷總量的含量測定結果，人參皂苷Rg1，Re，Rb1總量在本試驗的轉移率為100.8%，考慮到西洋參藥材中待測成分的波動，同時參考2015年版《中國藥典（一部）》“西洋參”藥材中人參皂苷總量含量限度的規定，西洋參含量限度暫規定為：本品每粒含西洋參以人參皂苷 Rg1 (C42H72O14)、人參皂苷 Re(C48H82O8)和人參皂苷 Rb1 (C54H92O23)的總量計，不得少于4.0 mg。

根據芪藥消渴膠囊的處方和制備工藝，參照2010年版《中國藥典（一部）》“西洋參”含量測定方法和文獻[1，6－8]，以水飽和的正丁醇為提取溶劑，分別用超聲處理1 h，加熱回流1，1.5，2 h制備供試品溶液，結果以加熱回流1.5 h 3種人參皂苷總量的含量較高，增加回流時間制備供試品溶液，3種人參皂苷總量的含量并未明顯提高。另外，通過改變試驗條件考察了西洋參含量測定的耐用性，分別用0.9，1.1 mL／min的流速或以30℃，35℃柱溫以及用其他品牌的C18色譜柱分別運行供試品溶液，結果待測定的色譜峰峰形、面積、分離度均無顯著變化。

西洋參為五加科植物西洋參 Pawajcquinquefolium L.的干燥根。西洋參及其主要活性成分具有滋補、強壯、抗疲勞、擴血管、益智、抗癌等多種作用[9]。現代研究顯示，某些人參皂苷具有治療糖尿病的作用，能提高血清中的胰島素水平。文獻[10－13]報道，西洋參中可能含有的焦谷氨酸不但能顯著地抑制腎上腺素誘導的脂肪分解，也能促進體內葡萄糖合成脂肪，從而降低血糖。張慧麗[14]從西洋參藥材中檢測到了焦谷氨酸，這為西洋參治療糖尿病提供了相應的理論依據。使用中藥治療糖尿病，或者改善糖尿病患者的癥狀是目前的糖尿病研究熱點之一[15]，賈繼明等[10]綜述了近年來國內外西洋參在治療糖尿病、控制糖尿病患者血糖方面的文獻報道，國外學者的大量研究表明，西洋參具有一定的降糖活性，尤其在降低2型糖尿病患者的餐后血糖方面有著明顯作用。

芪藥消渴膠囊是用于治療消渴病（糖尿病）的常用中藥制劑，西洋參作為芪藥消渴膠囊的君藥，對控制其皂苷類的含量有著重要意義。動物試驗顯示，芪藥消渴膠囊連續給試驗動物口服1周后，正常大鼠、小鼠及四氧咯吮糖尿病小鼠的血糖有了明顯降低[16]，這也印證了文獻[17－18]的報道。

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Quality Standard of Qiyaoxiaoke Capsule

Zhang Guoyue
(Shaanxi Institute for Food and Drug Control,Xi′an,Shaanxi,China 710065)

Objective To establish a method for quality control of Qiyaoxiaoke Capsule.M ethods The Radix Astragali,Radix Puerariae, Rhizoma Anemarrhenae in the preparation were analyzed qualitatively by TLC method,the Panax Quinquefolius in the preparation was quantified by RP－HPLC method.Ultimate C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)was adopted,acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution was the mobile phase,gradient elution,the flow rate was 1.0 mL／min,the column temperature was 40℃,the detection wavelength was 203 nm.Results TLC legal spots were clear and well separated.Rg1,Re and Rb1standard sample volume respectively in 0.985 9－14.788 5 mg,0.411 6－4.939 2 mg and 0.132 3－1.984 5 mg range showed a good linear relationship with the peak area,the recovery rates were 95.19%,97.84%,103.65%,RSD＝2.29%,2.97%,3.87%(n＝6).Conclusion The method is simple,accurate and reproducible,which can effectively control the quality of the product.

Qiyaoxiaoke Capsule;Radix Astragali;Radix Puerariae;Rhizoma Anemarrhenae;Panax Quinquefolius;TLC;RP－HPLC

R284.2

A

1006－4931(2017)15－0023－04

2017－03－06；

2017－05－10)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.15.007

張國躍（1959－），男，副主任藥師，中國管理科學研究院特約研究員，主要從事藥品、食品檢驗和中藥質量標準研究工作，（電話）029－62288444（電子信箱)zgy591959＠163.com。