大黃酸對便秘小鼠腸道傳輸功能和結腸肌電及結腸黏膜水通道蛋白3表達的影響

姜洪波 孫莉莉 劉伯語 王昊陽 何瑞芳 張瑞玲 張玉姣 杜愛林

(新鄉醫學院第三附屬醫院營養科，河南 新鄉 453003)

·基礎研究·

大黃酸對便秘小鼠腸道傳輸功能和結腸肌電及結腸黏膜水通道蛋白3表達的影響

姜洪波 孫莉莉1劉伯語 王昊陽1何瑞芳1張瑞玲2張玉姣1杜愛林1

(新鄉醫學院第三附屬醫院營養科，河南 新鄉 453003)

目的探討大黃酸對便秘小鼠腸道傳輸功能、結腸肌電及結腸黏膜水通道蛋白(AQP)3表達的影響。方法90只小鼠隨機分為對照組、便秘組和大黃酸組。用復方地芬諾脂片復制小鼠便秘模型后，大黃酸組用大黃酸灌胃治療。測量3組首便時間，6 h排便數量，大便性狀，小腸推進率，結腸肌電信號和結腸黏膜AQP3的表達。結果便秘組首粒排便時間較對照組顯著延長(P<0.01)，6 h內排便粒數顯著減少(P<0.01)，小腸推進率顯著降低(P<0.01)；大黃酸組首次排便時間較便秘組顯著縮短(P<0.01)，6 h內排便粒數顯著增加(P<0.01)，小鼠小腸推進率顯著提高(P<0.01)。3組結腸慢波近似于正弦波樣曲線，便秘組結腸慢波較不規則。與對照組相比，便秘組結腸慢波頻率顯著減慢(P<0.05)。與便秘組相比，大黃酸組結腸慢波頻率顯著增快(P<0.05)。與對照組相比，便秘組結腸慢波頻率變異系數顯著增大(P<0.05)；與便秘組相比，大黃酸組結腸慢波頻率變異系數顯著降低(P<0.05)；與對照組相比，便秘組結腸慢波振幅顯著降低(P<0.05)；與便秘組相比，大黃酸組結腸慢波振幅顯著升高(P<0.05)。與對照組相比，便秘組結腸慢波振幅變異系數顯著增大(P<0.05)；與便秘組相比，大黃酸組結腸慢波振幅變異系數顯著減小(P<0.05)。便秘組結腸AQP3平均光密度值及陽性面積表達率明顯高于對照組，大黃酸組結腸AQP3平均光密度值及陽性面積表達率明顯低于便秘組(均P<0.05)。結論大黃酸能夠有效地提高便秘小鼠的腸道傳輸功能，減少便秘小鼠結腸黏膜AQP3的表達，對緩解便秘具有顯著療效。

便秘；大黃酸；推進率；肌電；結腸；水通道蛋白3

便秘患者可并發痔瘡、肛裂、直腸脫垂和結腸憩室〔1〕。此外，還易患蕁麻疹、哮喘等過敏性疾病及膽結石癥，頭痛及肩凝癥等多種疾病。此外，便秘患者的有害毒素長期持續刺激腸黏膜，腸道菌群失調，極大地增加了患大腸癌的風險，便秘尚可誘發乳腺癌。對于高血壓、冠心病等心血管疾病患者，嚴重便秘可使血壓急劇上升，造成腦卒中甚至猝死。不僅如此，慢性便秘還可誘發老年癡呆及心肌梗死等嚴重疾病。尋找安全有效、副作用小的藥物很有價值意義。藥用大黃具有瀉熱通便，清濕熱的功能，用于實熱便秘、積滯腹痛、瀉痢黃疸等，臨床應用廣泛。大黃的主要成分之一大黃酸具有保肝、抗肝臟纖維化、防治糖尿病腎病(DN)、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫抑制、利尿等作用〔2，3〕。而傳統醫學認為大黃酸腸內菌轉化產物大黃酸蒽酮具有瀉下活性，能保護胃腸黏膜，清潔內環境，降脂減肥，延緩衰老等特點〔4〕。本文探討大黃酸對便秘小鼠腸道傳輸功能、結腸肌電及結腸黏膜水通道蛋白3(AQP3)表達的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 復方地芬諾酯片為江蘇平光制藥有限責任公司產品(批號：0805221，2.5 g/片)，大黃酸為北京鼎國昌盛生物技術責任有限公司產品，曙紅Y為上海永葉生物科技有限公司(CAS號：17372-87-1)，一抗兔抗鼠單抗AQP3(北京鼎國昌盛生物技術責任有限公司提供)，兔免疫組化檢測試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術責任有限公司提供)，磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH7.2～7.4)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒ZLI-9018(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：K1352222E)。BL-420F生物機能實驗系統，石蠟切片機，光學顯微鏡(Nikon Eclipse E200)。

1.2動物及分組 取小鼠30只，新鄉醫學院動物中心提供，雌雄兼用，體重22～30 g。適應性喂養1 w后隨機分成對照組、便秘組、大黃酸組，每組各10只。

1.3藥劑的配制 取復方地芬諾酯片2片加入蒸餾水5 ml配制成混懸液，用量0.1 ml/10 g。準確稱量大黃酸50 mg，加入蒸餾水10 ml，混合均勻，對大黃酸組小鼠灌胃治療，用量0.1 ml/10 g。取曙紅2 g加入蒸餾水10 ml配成混懸液。

1.4建模 建模前24 h禁食給水，按10 mg/kg復方地芬諾酯混懸液分別對便秘組和大黃酸組小鼠進行灌胃復制便秘模型。對照組用蒸餾水灌胃。每天觀察記錄糞便的形態、小鼠的體重及小鼠的毛發變化，并根據小鼠的糞便及體重變化情況適當增減給藥劑量。確定便秘模型復制成功，大黃酸組小鼠灌胃大黃酸1 w，實驗前均禁食不禁水14 h。便秘組和大黃酸組分別灌胃給予復方地芬諾酯片(10 mg/kg體重)和大黃酸(0.1 ml/10 g)，對照組用蒸餾水代替，0.5 h后，各組均給予曙紅0.1 ml/10 g后，記錄小鼠首粒紅便的時間，糞便的性狀，6 h大便粒數。

1.5小腸推進率的測定 大黃酸組小鼠灌胃大黃酸1 w后，各組均10只，均禁食不禁水14 h。便秘組和大黃酸組分別灌胃給予復方地芬諾酯片(10 mg/kg體重)和大黃酸(0.1 ml/10 g)，對照組用蒸餾水代替，0.5 h后，各組均給予曙紅0.1 ml/10 g，曙紅灌胃25 min后，將30只小鼠立即脫頸椎處死，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，置于玻璃板上，輕輕將小腸拉成直線，為小腸總長度，從幽門至曙紅前沿為曙紅推進長度。按下式計算曙紅推進率：曙紅推進率=曙紅推進長度(cm)/小腸總長度(cm)×100%。

1.6大黃酸對便秘小鼠結腸肌電活動的測定 建模方法同1.4，測定三組小鼠的結腸肌電。各組小鼠禁食不禁水24 h，用20%烏拉坦腹腔注射麻醉(0.3 ml/只)，仰臥在手術臺上，消毒后，沿下腹正中做約1.5 cm的縱行切口，顯露回盲部，在結腸近段(距盲腸約1 cm)肌漿層內插入一對銅絲電極，兩電極相距0.5 cm，銅絲與結腸和導線接觸處去除絕緣層，銅絲兩端與BL-420F生物機能實驗系統的導線相連。靈敏度選擇：增益放大倍數2 mV，時間常數0.001 s，高頻濾波為20 Hz。慢波趨于穩定后開始記錄，連續記錄45 min，重復記錄3次。

1.7結腸肌電活動參數分析 各組的記錄結果均用3 min作為一個時間段的頻率和振幅的均值、標準差及變異系數進行比較〔5〕。慢波頻率變異系數(%)=慢波頻率標準差/慢波頻率均值×100%；慢波振幅變異系數(%)=慢波振幅標準差/慢波振幅均值×100%。

1.8免疫組化法檢測小鼠結腸AQP3 建模方法同1.4。建模完成后，各組小鼠均禁食不禁水24 h，20%烏拉坦腹腔注射麻醉(0.3 ml/只)后，取小鼠近段結腸，用4%的多聚甲醛溶液進行固定，脫水，石蠟包埋，切片，切片厚度為7 μm。常規脫蠟，復水，免疫組織化學技術染色，二抗濃度為1∶200，中性樹膠封片，晾干。在400倍光鏡下觀察AQP3的表達情況，以有明顯棕褐色顆粒的細胞為陽性細胞，選擇5個完整不重疊視野，用Image pro-Plus6.0軟件統計分析每個視野的平均光密度值和陽性面積表達率。

1.9統計學處理 采用t檢驗。

2 結 果

2.1各組小鼠排便情況比較 對照組及大黃酸組較便秘組小鼠的糞便濕潤、粒長、柔軟，便秘組小鼠大便性狀干結、質硬、粒短。大黃酸組小鼠6 h內排便的粒數較便秘組明顯增多(P<0.01)，首粒紅便排出的時間較便秘組明顯縮短(P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠排便情況比較

與便秘組比較：1)P<0.01,下表同

2.2各組小鼠小腸推進率比較 大黃酸組小鼠小腸推進率較便秘組小鼠小腸推進率明顯增大，大黃酸對便秘小鼠小腸推進功能有顯著促進作用(P<0.01)，見表2。

表2 各組小腸推進率比較

2.3各組小鼠結腸肌電變化比較 各組小鼠的結腸慢波曲線近似為正弦波。與對照組比較，便秘組小鼠的結腸慢波頻率顯著減慢(P<0.05)；與便秘組比較，大黃酸組小鼠的結腸慢波頻率明顯增快(P<0.05)。與對照組相比，便秘組小鼠的結腸慢波頻率變異系數明顯增大(P<0.05)，與便秘組比較，大黃酸組小鼠的結腸慢波頻率變異系數明顯降低(P<0.05)。與對照組比較，便秘組小鼠的結腸慢波振幅顯著減少(P<0.05)；與便秘組比較，大黃酸組小鼠的結腸慢波振幅顯著升高(P<0.05)。與對照組比較，便秘組小鼠的結腸慢波振幅變異系數顯著增大(P<0.05)；大黃酸組小鼠的結腸慢振幅率變異系數與便秘組相比，大黃酸組小鼠的結腸慢波振幅變異系數明顯減小(P<0.05)，見表3及圖1。

表3 各組結腸慢波頻率、頻率變異系數及振幅、振幅變異系數比較

與便秘組比較:1)P<0.01,2)P<0.05

圖1 各組結腸肌電圖

2.4結腸黏膜AQP3表達情況 上皮細胞AQP3陽性表達為棕褐色顆粒，結腸黏膜AQP3主要分布在上皮細胞基底部的細胞質和細胞頂部。正常組AQP3主要表達于吸收細胞，杯狀細胞表達較少。便秘組吸收細胞和杯狀細胞幾乎都有AQP3表達，染色較深。大黃酸組與便秘組相比AQP3表達主要以吸收細胞為主，表達較少。便秘組AQP3的平均光密度值明顯高于對照組〔(47.86±2.01) vs (33.24±2.75)，P<0.01〕，大黃酸組平均光密度值明顯低于便秘組〔(40.15±3.10)，P<0.01〕，便秘組小鼠結腸AQP3的陽性面積表達率明顯高于對照組〔(33.13±1.95)% vs (22.77±1.95)%,P<0.05〕，大黃酸組結腸AQP3的陽性面積表達率明顯低于便秘組〔(27.83±1.86)%,P<0.05〕，見圖2。

圖2 各組結腸上皮細胞AQP3的免疫組化表達(DAB，×400)

3 討 論

便秘是一種臨床常見的復雜癥狀，主要表現為便意少，便次也少；排便艱難、費力；排便不暢；大便干結、硬便，排便不凈感；便秘伴有腹痛或腹部不適。部分患者還伴有失眠、煩躁、多夢、抑郁、焦慮等精神心理障礙。其病因復雜，分為器質性和功能性。特別是現在因生活習慣的改變，工作性質和時間變化，飲食不規律，精神因素等多種原因的影響，便秘的發生率逐年上升，并且年齡愈來愈小，發生率隨年齡的增加而增加。便秘的“報警”征象包括便血、貧血、消瘦、發熱、黑便、腹痛等和腫瘤家族史。干結的大便蓄積在腸道會損傷腸黏膜而致便血、肛裂和痔瘡。由于排便不暢，毒素蓄積，還會引起腹痛、腹脹、便不凈感、消化不良，頭暈、頭痛、全身乏力等一系列癥狀。另外，便秘增加患癌癥的風險，心血管疾病，糖尿病，免疫力下降，皮膚病，早衰，風濕，寄生蟲污染，女性經期不順，痛經等。

大黃酸是大黃發揮瀉下作用的主要活性物質之一，在大黃游離蒽醌中占的比例較大且較穩定。大黃酸腸內菌轉化產物大黃酸蒽酮有瀉下活性，能夠降低結腸對鈉和氯離子的吸收，增加鉀離子分泌。目前國內已有單體大黃酸作為一類新藥已被國家科技部列為“十五”國家重大科技專項，現階段大黃酸已成為國內外研究的熱點，是配制保健品的最佳原料，可用于降脂減肥，清潔內環境，預防胃癌，保護胃黏膜，延緩衰老等方面，涉及的領域逐漸廣泛。本文結果說明大黃酸對便秘小鼠有潤便通便的作用，增強腸道傳輸的功能。

慢波電位又稱基本電節律，是消化道平滑肌特有的電變化，是細胞自發性節律性去極化形成的。慢波是局部電位，起源于縱行肌，它雖然不能直接引起平滑肌收縮，但動作電位只能在慢波電位的基礎上產生，因此慢波是平滑肌的起步電位，控制平滑肌收縮的節律。慢波是靜息電位基礎上產生的緩慢的節律性去極化波；它的產生可能與細胞膜生電鈉泵的周期活動有關；結腸肌電動作電位產生于慢波之上，與平滑肌收縮一致，是結腸推進性運動的主要動力，慢波是相對規律的一種周期性電活動，無論收縮與否始終存在〔6〕，可間接反映結腸動力狀況。因此，結腸慢波的頻率和振幅可以作為反映結腸功能的一項客觀電生理指標。變異系數反映同組內不同時間段頻率和振幅的差異，用于衡量結腸活動節律的穩定性〔7〕。本文結果提示便秘組小鼠的慢波頻率減慢及振幅降低，可能導致動作電位不易發生，從而使消化道平滑肌收縮減弱，致使腸道傳輸功能降低，導致糞便在腸內蓄積不易排出，引起便秘；大黃酸可能通過提高結腸肌電頻率和振幅使動作電位易于產生，加快平滑肌收縮的節律，使腸道蠕動增加、傳輸功能提高，增加排便動力，加快糞便在結腸的排出速度。大黃酸組小鼠結腸傳輸功能的增強可能與大黃酸腸內菌轉化產物大黃酸蒽酮的降低結腸對鈉和氯離子的吸收，增加鉀離子分泌的作用有關，而結腸細胞膜生電鈉泵的周期活動的改變可能通過結腸慢波頻率和振幅的改變來表現。大黃酸作用于便秘小鼠使便秘小鼠的慢波頻率變異系數及慢波振幅變異系數均降低，說明結腸電生理活動穩定性增加，提示大黃酸有效地改善了便秘小鼠的結腸動力異常，穩定結腸慢波節律。大黃酸在短期內能有效緩解便秘，但長期應用是否會因大黃酸長久持續地增加結腸收縮波的數目而導致腸道收縮節律紊亂，還需進一步實驗研究。

AQP3是水通道蛋白家族中的一個亞型，位于人類染色體9p13，其基因有4個外顯子和3個內含子。AQP3組成為292個氨基酸，分子量為31 544 D。它可以轉運水分子和溶質〔8〕。AQP3在結腸表達最高，主要位于近端結腸吸收上皮細胞的基底部和頂部〔9〕，其主要功能是將腸腔內的水和溶質從基底側轉移到細胞間隙中，減少結腸內的水分。因此，結腸黏膜AQP3表達的強度與糞便的性狀密切相關。本文結果提示大黃酸治療便秘的機制之一是通過下調結腸黏膜AQP3的表達，增加腸道水分，軟化大便，潤滑腸道內容物，減少排便阻力，從而使大便易于排出，起到緩解便秘的作用。

蒽醌類物質具有瀉下作用，大黃酸屬蒽醌類物質，但大黃酸對治療便秘的作用機制尚未完全清楚。血管活性腸肽(VIP)是消化系統中主要的抑制性遞質，存在于中樞神經和腸神經系統中，在腸道中十二指腸和結腸含量最高〔10〕，VIP對結腸水和電解質的分泌有很強的促進作用，對消化道平滑肌的收縮產生抑制作用。AQP3是VIP作用的靶分子之一。有研究表明VIP可以通過細胞蛋白激酶A 系統改變膜上水通道蛋白的含量來調節膜對水的通透性〔11〕。在便秘模型鼠小腸和結腸VIP含量均減少〔12〕，推測便秘的形成可能與腸神經系統中VIP能神經病理改變或功能障礙調節VIP含量和AQP3的表達有關。這些變化可能使腸道的節段性蠕動增加，而有效的推進性蠕動減少，導致便秘。便秘小鼠結腸功能的減弱可能經慢波頻率和振幅的變化而來表現。有研究指出，大黃可使大鼠胃動素(MTL)和P物質(SP)含量升高，VIP含量降低〔13〕。推測大黃可能通過大黃酸作用于MTL、SP、VIP而使胃腸激素分泌增多、結腸推進功能增強，而結腸推進功能的增強可能通過結腸慢波頻率和振幅的變化來表現。本實驗中大黃酸組結腸黏膜AQP3表達減少，推測大黃酸可能調節VIP的含量，下調結腸黏膜AQP3的表達。上皮細胞頂質膜分布有鈉通道，基底膜有Na+-K+-ATP酶，推測大黃酸可能通過調節鈉通道蛋白和Na+-K+-ATP酶，Na+-K+-ATP酶將上皮細胞內的鈉主動轉運到上皮細胞間質速度降低，細胞內鈉濃度降低速度減慢，使腸腔內水和鈉分別通過頂質膜上AQP3和鈉通道蛋白進入上皮細胞減少，從而使基底膜上水通道蛋白和Na+-K+-ATP酶經間質內毛細血管重吸收回體內的水的量減少，腸腔內水分增加，起到軟化大便，增加腸內容物，增加腸道蠕動，減少排便阻力的作用，從而緩解小鼠便秘。但大黃酸對其他水通道蛋白亞族及胃腸激素的影響有待進一步實驗研究。

1齊研楓.兒童便秘的危害及治療〔J〕.中國醫藥指南，2013；11(18)：793-4.

2李曉云.大黃酸抗炎作用及機理研究〔D〕.北京：北京協和醫學院研究生院，2010.

3李曉紅，李 蒙，陶艷蓉.大黃酸及其衍生物藥理作用研究新進展〔J〕.現代藥物與臨床，2010；25(6)：417-21.

4彭勝男，曾慧紅，傅愛香，等.大黃酸對大鼠腸黏膜的保護作用觀察〔J〕.山東醫藥，2012；47(1)：21-3.

5盧智敏，姜洪波，杜愛林，等.蘆薈全汁對便秘小鼠結腸肌電生理變化的影響〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(5)：1068-9.

6Bayguinov PO，Hennig GW，Smith TK.Calcium imaging of myenteric neurons and ICC during local mucosal reflexes and the colonic migrating motor complex in the murine colon (Abstract)〔J〕.Neurogastroenterol Motil，2009；21(2)：319-41.

7Dickson EJ，Hennig GW，Heredia DJ，etal.Polarized intrinsic neural reflexes in response to colonic elongation〔J〕.J Physiol，2008;86(16)：4225-40.

8Fujiyoshi Y，Mitsuoka K，de Groot BL，etal.Structure and function of water channels〔J〕.Curr Opinstruct Biol,2002;12(4)：509-15.

9Itoh A，Tsujikawa T，Fujiyama Y，etal.Enhancement of aquaporin-3 by vasoactive intestinal polypeptide in a human colonic epithelial cell line〔J〕.J Gastroenterol Hepatol，2003;18(2)：203-10.

10程曉雯，鄭清華，李小玲，等.血管活性腸肽與某些胃腸動力紊亂性疾病的內在關聯研究進展〔J〕.中國全科醫學，2012;15(10)：237-40.

11Harmar AJ，Sheward WJ，Morrison CF，etal.Distribution of the VPAC 2 receptor in peripheral tissues of the mouse〔J〕.Endocrinology，2004;145(3)：1203-10.

12趙士彭，趙 發，馮文斌，等.便秘大鼠腸道血管活性腸膚的變化及其臨床價值〔J〕.山東醫藥,2006;6(3)：27-8.

13朱金照，冷恩仁，史洪濤，等.大黃促進腸道運動的機制探討〔J〕.解放軍藥學學報，2002;18(6)：339-40，346.

〔2015-12-15修回〕

(編輯 曹夢園)

EffectsofRheinontheintestinaltransmissionfunctionandaquaporin-3inmice

JIANGHong-Bo,SUNLi-Li,LIUBo-Yu,etal.

TheThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang453003,Henan，China

ObjectiveTo study Rhein on the intestinal transmission function and the effect of the expression of aquaporin(AQP)3 in the colonic mucosa of mice with constipation.Methods30 male mice were randomly divided into control, constipation and Rhein groups. Bowel transit function was measured by eosin propulsion test and recorded the first defecation time, the number of red stool in the initiative 6 hours and promoting rate of eosin. Immunohistochemistry was used to detect the expression of AQP3 in colon mucosa.ResultsThe grain number of red stool in 6 hours of constipation group was lessen than that of control group, associated with prolong of the first defecation time(P<0.01). Compared with constipation group, the first defecation time were shortened and the grain number of the defecation red stool in 6 hours of the mice increased(P<0.01),and promoting rate of mice small intestine were markedly increased in control group and Rhein group(P<0.01). There were significant differences in colonic myoelectricity of mice slow-waves frequency, slow-waves frequency variation coefficient, colonic myoelectricity of mice slow-waves amplitude, slow-waves amplitude variation coefficient, the expression of the mean optic density of AQP3 in colonic mucosa between constipation and control groups, constipation and Rhein groups(P<0.05).ConclusionsRhein could improve motor function in mice colon, reduce expression of AQP3 in colon mucosa, and has significant effects on the treatment of constipation.

Constipation; Rhein; Promoting rate; Myoelectricity; Colon; Aquaporin-3

國家自然科學基金(31600935)；國家級大學生創新創業訓練計劃(20160472013)；河南省教育廳課題(15A310006)；河南省衛生科技創新型人才工程專項經費(3052)；河南省高?？萍紕撔聢F隊(17IRTSTHN023)

張玉姣(1986-)，女，講師，博士，碩士生導師，主要從事神經損傷與認知研究。 杜愛林(1972-)，男，副教授，碩士，主要從事神經損傷與營養研究。

姜洪波(1980-)，女，主治臨床營養師，主治醫師，講師，碩士，主要從事神經損傷與營養研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)17-4169-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.001

1 新鄉醫學院生理學與神經生物學教研室 中英腦功能損傷聯合實驗室 河南省高校腦研究重點實驗室培育基地

2 新鄉醫學院第二附屬醫院 河南省生物精神病學重點實驗室