β淀粉樣蛋白25～35對PC12細胞凋亡相關蛋白表達的影響

王瑞婷 王愛霞 狄婷婷 張 美 申興斌

(承德醫學院，河北 承德 067000)

β淀粉樣蛋白25～35對PC12細胞凋亡相關蛋白表達的影響

王瑞婷 王愛霞 狄婷婷 張 美 申興斌1

(承德醫學院，河北 承德 067000)

目的探討β淀粉樣蛋白(Aβ)25～35對PC12細胞凋亡相關蛋白表達的影響。方法采用不同濃度的Aβ25～35與PC12細胞共孵育48 h后,用MTT法檢測細胞生長活性，Hoechst33258核染色檢測細胞凋亡，通過免疫細胞化學檢測細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達。結果MTT檢測顯示Aβ25～35抑制PC12細胞生長活性呈濃度依賴性，抑制作用隨Aβ25～35濃度的增大而加強；Hoechst33258染色顯示Aβ25～35與PC12細胞凋亡呈濃度依賴性關系；免疫細胞化學檢測結果顯示Bcl-2蛋白表達量隨Aβ25～35濃度的增大呈下降趨勢，Bax、Caspase-3蛋白表達量隨Aβ25～35濃度的增大呈上升趨勢。結論Aβ25～35可劑量依賴性誘導PC12細胞凋亡，使抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調，促凋亡蛋白Bax,Caspase-3表達上調。

β淀粉樣蛋白；PC12；凋亡；Bcl-2；Bax；Caspase-3

阿爾茨海默病(AD)患者腦內的老年斑由β淀粉樣蛋白(Aβ)異常沉積形成。Aβ作為AD發病的始動因子已得到廣泛的認可〔1〕，研究發現Aβ誘導神經元凋亡,其機制成為AD的發病機制研究熱點之一〔2,3〕。Aβ由39～43個氨基酸組成，引起神經毒性主要活性部位在第25～35氨基酸之間(Aβ25～35)〔4〕。Aβ對在體及體外神經元的毒性作用依賴于其聚集狀態與濃度，為進一步分析其作用機制，本課題分析離體實驗中Aβ25～35對PC12細胞凋亡相關蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1試劑 Aβ25～35(Lot：990307)由北京博奧森生物技術有限公司提供；MTT(Lot:08E21C01),一抗兔抗大鼠Bcl-2多抗(Lot:195841)、兔抗大鼠Bax多抗(Lot:11201)、兔抗大鼠Caspase-3多抗(Lot:Y-C4-08D22C),即用型SABC試劑盒(Lot：08A22C)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(Lot：08A04A22)，由武漢博士德生物工程有限公司提供。PC12細胞(CX0247)，胎牛血清(FBS)(Lot：10J30C01)由武漢博士德生物工程有限公司提供；DMEM(Lot:681841)由Gibco提供；胰酶(Lot:CAS#9035-81-8)由上海藍基科技發展有限公司提供。

1.2凝聚態Aβ25～35制備 用超純水將凍干的Aβ25～35充分溶解配置100 μmol/L母液并過濾分裝，-20℃保存，使用前于37℃恒溫箱孵育5～7 d使其形成凝膠態，取適量加入培養細胞中使達到所需終濃度。

1.3細胞培養 PC12細胞接種于培養皿中，培養在含10% FBS的高糖DMEM培養液中，內含青霉素、鏈霉素各100 U/ml,隔天換液，4 d傳一代。采用對數生長期的細胞進行實驗。

1.4MTT法檢測細胞生長活性 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度5×107/L，每孔加入100 μl，邊緣孔用無菌PBS填充,5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底;加入濃度梯度的Aβ25～35，使其終濃度為0.1、1、2、5、10、20 μmol/L，同時設立對照孔和調零孔,每組設4個復孔。培養48 h后，每孔加入10 μl MTT染色液，繼續培養4 h；每孔加入10 μl MTT染色液，繼續培養4 h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2～3遍后，再加入含MTT的培養液。每孔加入100 μl Formanzan溶解液，置搖床上低速振蕩10～30 min，使結晶物充分溶解；在酶聯免疫檢測儀570 nm測定吸光度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(加藥細胞OD-調零孔OD值)/(對照細胞OD-調零孔OD值)×100%。

1.5細胞爬片制備 取在70%乙醇中浸泡的潔凈蓋玻片，用無菌的PBS溶液洗滌3遍，再用細胞培養液洗滌1遍，將蓋玻片置于24孔板，種入對數生長期細胞培養過夜，使爬片約為80%滿。由MTT檢測結果選擇3個濃度梯度的Aβ25～35,刺激細胞48 h,并設置對照組。48 h后，吸盡培養液，加入0.5 ml固定液，固定10 min,去固定液，自然晾干5 min,用PBS洗兩次，每次3 min，吸盡液體，4℃保存備用。

1.6Hoechst33258核染色 每張爬片加入0.5 ml Hoechst33258染色液，染色5 min；去染色液，用PBS洗兩遍，每次3 min，吸盡液體；滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的爬片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡；熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核，激發波長350 nm左右，發射波長460 nm左右。

1.7免疫細胞化學染色 細胞爬片用0.25%TritonX-100室溫處理15 min,PBS洗3次，用3%H2O2室溫處理15 min以滅活內源性酶,PBS洗3次，5%BSA37℃封閉20 min，吸盡封閉液，不漂洗；加一抗Bcl-2(1∶100)、Bax(1∶100)、Caspase-3(1∶100)，4℃過夜。第2天37℃孵育25 min，PBS洗3次，山羊抗兔IgG 37℃孵育20 min,PBS洗3次，SABC37℃孵育20 min,PBS洗3次，DAB顯色2～10 min，光鏡下觀察陽性顯色為棕黃色，用蒸餾水沖洗10 min終止反應。蘇木素輕度復染5～10 min，70%、80%、95%、100%乙醇各5 min,二甲苯10 min,甘油封片后光學顯微鏡進行觀察。每組選取3張爬片，光鏡下每張爬片隨機選取3個不重復視野在400倍視野下采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統，測量每組爬片的平均光密度值，用于定量分析免疫細胞化學陽性反應程度。

1.8統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1Aβ25～35對PC12細胞活力的影響 Aβ25～35與PC12細胞活力呈現濃度依賴性的關系，低濃度Aβ25～35對PC12細胞活力影響小，隨著Aβ25～35濃度的增大，PC12細胞活力明顯受到抑制。1 μmol/L以上濃度組Aβ25～35刺激48 h后即可出現細胞活力明顯下降(P<0.05),Aβ25～35濃度達到10 μmol/L時，細胞存活率達到48.7%，此濃度已顯示出較強的細胞毒性作用。后續實驗采用0、1、5、10 μmol/L的Aβ25～35。見表1。

表1 不同濃度Aβ25～35對PC12細胞細胞活力的影響

與0 μmol/L Aβ25～35比較：1)P<0.05；與0.1 μmol/L Aβ25～35比較：2)P<0.05

圖1 不同劑量Aβ25～35對PC12細胞凋亡的影響(Hoechst33258,×400)

2.2Hoechst33258核染色觀察Aβ25～35對PC12細胞凋亡的影響 見圖1。Hoechst33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈藍色，凋亡細胞的細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發白。實驗采用0、1、5、10 μmol/L的Aβ25～35作用PC12細胞48 h，顯示對照組細胞的細胞核呈藍色，僅有個別細胞的細胞核顏色有些發白；而Aβ25～35組細胞,呈現細胞核濃染或顆粒狀熒光團塊增多，隨Aβ25～35濃度增大細胞核呈碎塊狀致密濃染，顏色發白的趨勢增強，即Aβ25～35與PC12細胞凋亡呈濃度依賴性關系。

2.3不同濃度Aβ25～35對PC12細胞Bcl-2表達水平的影響 鏡下可見PC12細胞Bcl-2陽性反應為胞質棕黃色顆粒，有時可見核膜著棕黃色。Bcl-2免疫細胞化學顯示對照組和不同濃度Aβ25～35組均有Bcl-2陽性表達，與對照組相比，不同濃度Aβ25～35組Bcl-2陽性表達均明顯減少(P<0.05);隨著濃度增加Bcl-2陽性表達逐漸減少，不同濃度組間差異顯著(P<0.05)。Bcl-2表達量與Aβ25～35濃度相關，Aβ25～35濃度越大，Bcl-2陽性表達越少。見圖2，表2。

2.4不同濃度Aβ25～35對PC12細胞Bax表達的影響 PC12細胞Bax陽性反應為胞質棕黃色顆粒,有時可見核膜著棕黃色。與對照組相比，各Aβ25～35組Bax陽性表達均明顯增加(P<0.05)，隨Aβ25～35濃度增加Bax陽性表達逐漸增加，10 μmol/L組胞核黃染，著色深，不同Aβ25～35組間比較有統計學差異(P<0.05)。Bax表達量與Aβ25～35濃度相關，Aβ25～35濃度越大，Bax陽性表達越多。見圖3，表2。

圖2 不同劑量Aβ25～35對PC12細胞Bcl-2 表達的影響(DAB，×400)

表2 不同濃度Aβ25～35對PC12細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3表達水平的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與1 μmol/L Aβ25～35比較：2)P<0.05；與5 μmol/L Aβ25～35比較：3)P<0.05

2.5不同濃度Aβ25～35對PC12細胞Caspase-3表達水平的影響 PC12細胞Caspase-3陽性反應為胞質著棕黃色顆粒。與對照組相比，不同濃度Aβ25～35組Caspase-3陽性表達均明顯增加(P<0.05);隨Aβ25～35濃度增加，Caspase-3陽性表達逐漸增強，10 μmol/L組胞核黃染，著色深，不同濃度組間比較有統計學差異(P<0.05)。Caspase-3表達量與Aβ25～35濃度相關，Aβ25～35濃度越大，Caspase-3陽性表達越多。Caspase-3的表達量與Aβ25～35濃度呈依賴性相關。見圖4，表2。

圖4 不同劑量Aβ25～35對PC12細胞Caspase-3表達的影響(DAB，×400)

3 討 論

研究表明凋亡是AD病程中神經元大量丟失的主要原因〔5，6〕,但其具體機制尚不明確。細胞凋亡是受促凋亡基因和抑制凋亡基因協同控制的細胞主動死亡過程。目前認為Bcl-2,Bax,Caspase-3基因與凋亡調控關系更為密切。Bcl-2基因促進細胞增殖，過度表達可特異性抑制細胞凋亡。有研究證實Bcl-2過表達可減輕中樞神經系統損傷導致的神經元凋亡〔7～9〕，可能減少中樞神經系統損傷后神經元病理后遺癥〔10〕。本實驗結果顯示隨著Aβ濃度的增大，Bcl-2 表達逐漸減弱，對神經元保護作用減弱，神經元凋亡明顯。Bcl-2抗凋亡的機制目前認為主要有：拮抗促凋亡基因Bax；抑制促凋亡的蛋白質細胞色素C自線粒體釋放到胞質；阻止胞質中的細胞色素C激活Caspase；有抗氧化及維持細胞內鈣穩態等作用。Bax基因屬于Bcl-2 基因家族，編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2 產生阻抑作用。Bax基因過度表達加速細胞凋亡，并對抗Bcl-2基因抑制細胞凋亡的作用〔11，12〕。研究發現Bax/Bcl-2蛋白之間的比例關系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素〔13〕，促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2在中樞神經系統均有表達，其比值的大小決定神經元受到凋亡信號刺激后趨向于存活與凋亡的抉擇，形成細胞凋亡調控的按鈕〔14〕。有研究發現上調Bax蛋白水平的表達和Bax/Bcl-2比值增大可誘導神經元凋亡〔15〕，腦室內低溫能夠通過上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平降低急性腦缺血后神經元凋亡〔16〕。劉真苓等〔17〕研究發現腺苷處理后可減少犬脊髓缺血再灌注后神經元凋亡，其保護作用可能與Bax表達減少和Bcl-2表達增多有關。近期有研究學者發現梔子苷通過上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平，下調促凋亡蛋白Bax表達水平及轉錄因子p53水平可延緩AD的發展〔18〕。本實驗發現隨著Aβ濃度增大，抗凋亡的Bcl-2表達逐漸降低，促凋亡的Bax表達逐漸增強，Bax/bcl-2比值增加，神經元凋亡明顯。促凋亡的Bax與抗凋亡的Bcl-2兩者之間的比值同時決定促凋亡基因Caspase-3的激活程度〔19〕。Caspase-3在細胞凋亡中起著不可替代的作用，Caspase-3激活與cyt-c自線粒體釋放、線粒體損傷、神經元凋亡密切相關〔20〕。Caspase-3是激活細胞凋亡的關鍵因子，進一步激活其它凋亡蛋白表達，致細胞不可逆性凋亡。由死亡受體、線粒體/細胞色素、內質網介導的細胞凋亡的三類信號通路，最終均會引起Caspase瀑布效應〔21〕。Aβ可以引起活性氧(ROS)增多〔22〕，通過ROS引起cyt-c釋放，激活Caspase引起Caspase依賴性凋亡。本實驗發現高濃度Aβ使Bax/Bcl-2比值增大，Caspase-3表達增加。本研究組在整體實驗研究中也發現Aβ對凋亡相關蛋白表達的影響〔23〕。

Aβ25～35能夠劑量依賴性地誘導PC12細胞凋亡，其機制可能為通過下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，上調促凋亡蛋白Bax,Caspase-3表達實現。因此，進一步通過篩選具有上調Bcl-2蛋白表達,抑制Bax,Caspase-3蛋白表達活性，抑制神經元凋亡，延緩AD病程發展的藥物，將成為AD的研究熱點之一。

1Hardy J,Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease:progress and problems on the road to therapeutics〔J〕.Science，2002；297(5580):353-6.

2Miguel-Hidalgo JJ,Paul IA,Wanzo V,etal.Memantine prevents cognitive impairment and reduces Bcl-2 and caspase 8 immunoreactivity in rats injected with amyloid β(1-40)〔J〕.Eur J Pharmacol，2012；692(1-3):38-45.

3Xu J,Zhang R,Zuo P,etal.Aggravation effect of isoflurane on Aβ(25-35)-induced apoptosis and tau hyperphosphorylation in PC12 cells〔J〕.Cell Mol Neurobiol,2012;32(8):1343-51.

4Yankner BA,Duffy LK,Kirschner DA.Neurotrophic and neurotoxic effects of amyloid beta protein:reversal by tachykinin neuropeptides〔J〕.Science，1990；250(4978):279-82.

5Armstrong RA.Plaques and tangles and the pathogenesis of Alzheimer ′s disease〔J〕.Folia Neuropathol，2006；44(1):1-11.

6黃濤波，呂 誠，胡小令，等.β-淀粉樣蛋白所致神經細胞凋亡在阿爾茨海默病中的作用〔J〕.實用臨床醫學，2010；11(6):127-30.

7Wei L,Cui L,Snider BJ,etal.Transplantation of embryonic stem cells overexpresssing Bcl-2 promotes functional recovery after transient cerebral ischemia〔J〕.Neurobiol Dis，2005；19(1-2):183-93.

8牛英才，潘 志，李曉明，等.葛根異黃酮對MPP+誘導的PC12細胞凋亡的保護作用〔J〕.中國藥理學通報，2009；25(1):112-5.

9職玉娟，黃水清.黃芪總皂苷對H2O2誘導心肌細胞凋亡的保護作用〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2013；24(1):10-3.

10Zhao H,Yenari MA,Cheng D,etal.Bcl-2 overexpression protects against neuron loss within the ischemic margin following experimental stroke and inhibits cytochrome c translocation and caspase-3 activity〔J〕.J Neurochem,2003；85(4):1026-36.

11Cheng EH,Wei MC,Weiler S,etal.BCL-2,BCL-X(L)sequester BH3 domain-only molecules preventing BAX-and BAK-mediated mitochondrial apoptosis〔J〕.Mol Cell，2001；8(3):705-11.

12Marani M,Tenev T,Hancock D,etal.Identification of novel isoforms of the BH3 domain protein Bim which directly activate Bax to trigger apoptosis〔J〕.Mol Cell Biol，2002；22(11):3577-89.

13尚振德，張相彤，謝春成.葛根素對創傷性腦損傷神經細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響〔J〕.中華神經外科疾病研究雜志，2012；11(2)：105-8.

14Bouillet P,Purton JF,Godfrey DI,etal.BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes〔J〕.Nature，2002；415(6874):922-6.

15許維澄，林小雯，王群波，等.高濃度醫用臭氧對大鼠運動功能和脊髓Bax、Bcl-2表達的影響〔J〕.中國疼痛醫學雜志，2013；19(2):95-7.

16李 振，姚長義，楊明飛.腦室內低溫對兔急性腦缺血后Bcl-2表達及神經細胞凋亡的影響〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(5)：1088-9.

17劉真苓，劉懷普，郭惠明，等.腺苷處理后犬脊髓缺血再灌注損傷中神經元凋亡及相關蛋白表達的變化〔J〕.中華胸心血管外科雜志，2014；30(2)：90-3.

18王 磊，辛文峰，張文生.梔子苷治療阿爾茨海默病及神經保護的分子機制研究進展〔J〕.中國藥理學通報，2012；28(5)：604-7.

19Croker BA,Odonnell JA,Nowell CJ,etal.Fas-mediated neutrophil apoptosis is accelerated by Bid,Bak and Bax and inhibited by Bcl-2 and Mcl-1〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2011；108(32):13135-40.

20Musatov A,Robinson NC.Susceptibility of mitochondrial electron-transport complexes to oxidative damage.Focus on cytochrome c oxidase〔J〕.Free Radic Res，2012；46(11):1313-26.

21Daniel PT.Dissecting the pathways to death〔J〕.Leukemia，2000；14(12):2035-44.

22王瑞婷，關麗華，周 健，等.黃芩莖葉總黃酮對 Aβ25-35 致大鼠學習記憶損傷及海馬抗氧化酶活性的影響〔J〕.神經藥理學報，2011；1(2):14-8.

23Wang RT,Shen XB，Xing EH,etal.Scutellaria baicalensis stem-leaf total flavonoid reduces neuronal apoptosis induced by amyloid beta-peptide(25-35)〔J〕.Neural Regene Res，2013；8(12)：1081-90.

〔2016-05-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河北省教育廳重點資助課題(No.ZD20131051);河北省高校省級重點學科項目資助(〔2013〕4號);河北省中醫藥抗癡呆重點研究室資助(2014年)

王瑞婷(1969-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事中藥抗癡呆作用及機制研究。

R749

A

1005-9202(2017)17-4179-05；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.005

1 承德醫學院附屬醫院