三陰乳腺癌原發灶和轉移灶中ER-α36、EpCAM、Sox2的表達及臨床意義

李佳藝 游雪葉 葉煌陽 張映紅

(廈門大學附屬第一醫院廈門市腫瘤醫院腫瘤內科，福建 廈門 361000)

三陰乳腺癌原發灶和轉移灶中ER-α36、EpCAM、Sox2的表達及臨床意義

李佳藝 游雪葉1葉煌陽 張映紅

(廈門大學附屬第一醫院廈門市腫瘤醫院腫瘤內科，福建 廈門 361000)

目的探討雌激素受體(ER)-α36、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、性別決定區Y框蛋白(Sox)2在三陰乳腺癌(TNBC)原發灶和轉移灶中的表達及臨床意義。方法TNBC患者的石蠟標本62例，其中48例有對應的術后轉移灶石蠟標本，采用免疫組織化學法檢測ER-α36、EpCAM、Sox2在48例TNBC原發灶和相應轉移灶中的表達情況，分析ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白表達與TNBC患者臨床病理特征的關系，并且分析TNBC組織中ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白之間的關系。結果在TNBC原發灶和轉移灶中ER-α36、Sox2的高表達率差異有統計學意義(P<0.05)，EpCAM的高表達率差異無統計學意義(P>0.05)。TNBC組織中，ER-α36的高表達與淋巴結轉移有關(P<0.05)，EpCAM的高表達與腫瘤的組織學分期有關(P<0.05)，而Sox2的高表達與淋巴結轉移和腫瘤TNM分期有關(P<0.05)，EpCAM與Sox2的表達存在正相關性(r=0.790，P<0.05)。結論ER-α36和Sox2的高表達提示著TNBC的高侵襲性，且EpCAM與Sox2在TNBC的侵襲轉移中發揮著協同作用，ER-α36、EpCAM、Sox2均可作為TNBC侵襲轉移的潛在分子治療靶標。

三陰乳腺癌；雌激素受體-α36；上皮細胞黏附分子；性別決定性Y框蛋白；轉移

三陰乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體(HER)2均表達陰性的乳腺癌，其惡性程度高，易轉移，患者預后差。因其ER表達陰性，TNBC患者并不能受益于內分泌治療，而針對HER2的靶向治療在TNBC患者的治療中也無法發揮作用〔1〕。ER-α36發揮著與ER-α截然不同的生理效應，在TNBC的發生發展、侵襲轉移、內分泌及化療耐藥中發揮著重要功能〔2〕。上皮細胞黏附分子(Sox)2是一種與性別決定區Y(SRY)蛋白相關的轉錄因子，兩者在多種惡性腫瘤細胞中過表達，與腫瘤的侵襲轉移密切相關〔3〕。EpCAM及Sox2屬于腫瘤干細胞標志物，在正常乳腺上皮細胞內并不表達，在不同乳腺癌細胞中的表達也各有差異。以上三者在乳腺癌的侵襲轉移過程發揮著重要功能，但目前關于ER-α36、EpCAM以及Sox2在TNBC原發灶和轉移灶中表達差異的研究尚少，本研究旨在探討ER-α36、EpCAM、Sox2 在TNBC患者原發灶和轉移灶中的表達情況。

1 材料與方法

1.1對象 收集1996年3月至2015年9月入住廈門大學附屬第一醫院的TNBC患者的石蠟標本62例，均經病理組織學確診，其中48例有對應的術后轉移灶石蠟標本。患者均有完整的病歷資料，知情同意，并經醫院倫理委員會審核同意。

1.2試劑與方法 兔抗人ER-α36抗體(CY1109，北京四正柏生物科技有限公司)，鼠抗人EpCAM單克隆抗體(AUA1，ab20160，美國Abcam公司)；鼠抗人Sox2單克隆抗體(E4，sc365823，Santa Cruz公司)；SP試劑盒(上海酶聯生物公司)；二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。試驗標本均用4%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片。石蠟切片，常規脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，微波修復抗原，滴加正常山羊血清室溫封閉20 min，棄去血清，分別滴加ER-α36、EpCAM、Sox2一抗工作液，37℃孵育2 h，PBS洗滌后，滴加生物素二抗，室溫孵育30 min，PBS洗滌后，DAB顯色，沖洗，蘇木素復染，封片。以PBS替代一抗作陰性對照。

1.3結果判定 ER-α36染色定位在細胞膜和細胞質，EpCAM染色定位在細胞膜，Sox2染色定位在細胞核。采用Mathew〔4〕積分法進行結果判斷。每例標本均選擇10個含有陽性細胞的高倍視野(×400)分別計數100個細胞，取其平均值計算陽性細胞百分率。按陽性細胞百分率判定：無陽性細胞為0分；≤25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。按染色程度判定：無陽性著色為0分；淺黃色為1分；深黃色為2分；棕黃色為3分。染色指數為陽性細胞百分率與染色強度之和：最小值0分，最大值6分。在統計分析中，將>3分判定為高表達；≤3分定為低表達或陰性。

1.4統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行χ2檢驗、Spearman等級相關性分析。

2 結 果

2.1ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白在TNBC原發灶和轉移灶的表達 ER-α36定位于細胞膜和細胞質，EpCAM定位于細胞膜，Sox2定位于細胞核，均呈現棕黃色顆粒。ER-α36在原發灶和轉移灶中的高表達率分別為56.25%和77.08%，差異具有統計學意義(χ2=4.688，P=0.030)；EpCAM分別為72.92%和75.00%，差異無統計學意義(χ2=3.740，P=0.053)；Sox2分別為52.08%和79.17%，差異具有統計學意義(χ2=7.804，P=0.005)。在48例患者中，有16例ER-α36在原發灶中低表達，而在轉移灶中為高表達；有12例EpCAM在原發灶中低表達，而在轉移灶中為高表達；有18例Sox2在原發灶中低表達，而在轉移灶中為高表達。見圖1。

2.2ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白表達與TNBC臨床病理特征的關系 TNBC患者的ER-α36蛋白表達與淋巴結轉移有關(P<0.05)，與患者的年齡、絕經狀態、腫瘤大小、組織學分期、TNM分期無關(P>0.05)；TNBC患者的EpCAM蛋白表達與組織學分期有關(P<0.05)，與患者的年齡、絕經狀態、腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期無關(P>0.05)；TNBC患者的Sox2蛋白表達與淋巴結轉移、TNM分期有關(P<0.05)，與患者的年齡、絕經狀態、腫瘤大小、組織學分期無關(P>0.05)。見表1。

圖1 TNBC組織中ER-α36、EpCAM、Sox2的免疫組化染色結果(×400)

表1 ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白表達與TNBC臨床病理特征的關系〔n(%)〕

2.3TNBC組織中ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白的關系 在TNBC組織中，ER-α36與EpCAM、Sox2的表達均不具有相關性(r=0.352，0.455；P=0.324，0.273)。但EpCAM與Sox2的表達在TNBC組織中存在正相關性(r=0.790，P=0.000)，兩者在TNBC的侵襲轉移中發揮著協同作用。Sox2低表達，EpCAM低表達11例，高表達12例；Sox2高表達，EpCAM低表達2例，高表達23例。

3 討 論

TNBC占乳腺癌患者的30%左右，這部分患者并不能受益于內分泌治療(如三苯氧胺，他莫昔芬等)和HER2靶向治療(如曲妥珠單抗等)，且易發生轉移，是TNBC患者預后差的主要原因〔5〕。

ER屬于配體依賴的核受體，能夠介導大部分的雌激素信號轉導，目前發現的人類ER主要分為兩個亞型：ER-α與ER-β，其中ER-α主要表達于乳腺和子宮組織中，針對ER-α設計的內分泌治療藥物，在乳腺癌患者的臨床治療中起到了非常好的治療效果，ER-α的表達水平是預測乳腺癌患者對內分泌治療療效和預后的關鍵指標。ER-α36是ER-α的一個分子量為36 kD的亞型，研究發現，ER-α36在乳腺癌的腫瘤形成、侵襲轉移以及內分泌耐藥中均發揮著重要的功能〔6〕。研究發現〔7〕，在MCF-7乳腺癌細胞內過表達ER-α36能夠促進細胞的侵襲轉移能力，同時，在MDA-MB-231乳腺癌細胞內敲除ER-α36的表達能夠抑制細胞的侵襲轉移能力〔8〕。本研究結果說明ER-α36的高表達促進了TNBC的轉移。

EpCAM是一種腫瘤相關抗原，在多種上皮腫瘤中過量表達，如乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌等，在德國EpCAM單克隆抗體(17-1A，edrecolomab)已被批準許可用于直腸癌的術后輔助化療〔9〕，目前已研制出含有edrecolomab的癌癥疫苗IGN-101〔10〕。EpCAM除了具有黏附分子的功能外，還參與了細胞增殖分化、遷移和免疫逃逸等多種生理活動。Soysal等〔11〕檢測了1 365例乳腺癌樣本中EpCAM的表達水平，其過表達率為48%，其中TNBC樣本中的過表達率為63.8%。本研究中，EpCAM的高表達率與組織分型有關，且TNBC患者的原發灶和轉移灶中EpCAM的高表達率分別為72.92%和75.00%，兩者之間的差異無統計學意義，但其表達水平遠遠超過了正常乳腺癌組織，仍然能夠受益于EpCAM單克隆抗體17-1A〔9〕。

轉錄因子Sox2屬于Sox基因家族，是維持干細胞特性的關鍵因子，與多種腫瘤的形成密切相關。在卵巢癌〔12〕、侵襲性神經膠質瘤〔13〕中，Sox2促進了腫瘤的發生，屬于原癌基因，但在胃癌中，Sox2的表達下調，又扮演了抑癌基因的角色〔14〕。Sox2并不在人正常乳腺組織中表達，在各種乳腺癌亞型中的表達也存在差異，Zheng等〔15〕的Meta分析結果顯示，Sox2在乳腺癌的表達率為38.18%。本研究中，Sox2的高表達與淋巴結轉移、腫瘤TNM分期關系密切，Sox2在TNBC原發灶和轉移灶中的高表達率分別為52.08%和79.17%，說明Sox2的高表達促進了TNBC的遠處轉移，可以作為預測TNBC侵襲轉移和不良預后的參考指標。

此外，本研究中發現EpCAM與Sox2在TNBC組織中的表達存在相關性。Lin等〔16〕發現中EpCAM可以上調Sox2的表達，從而促進腫瘤的形成。Abd-El-Magsoud等〔17〕檢測145例乳腺癌組織中EpCAM與Sox2的表達水平，證實EpCAM與Sox2之間存在著正相關性，與本研究的結果相符，EpCAM與Sox2可能在TNBC的侵襲轉移中發揮著協同作用。

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2李廣亮，滕理送.雌激素受體亞型ER-α36與乳腺癌關系的研究進展〔J〕.腫瘤防治研究，2016；43(3)：238-42.

3Raimondi C，Nicolazzo C，Gradilone A.Circulating tumor cells isolation：the post-EpCAM era〔J〕.Chin J Cancer Res，2015；27(5)：461-70.

4Mathew J，Pathrose S，Kottoor J，etal.Evaluation of an indigenously prepared herbal extract(EndoPam)as an antimicrobial endodontic irrigant：an ex vivo study〔J〕.J Int Oral Health，2015；7(6)：88-91.

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6Pan X，Zhao B，Song Z，etal.Estrogen receptor-α36 is involved in epigallocatechin-3-gallate induced growth inhibition of ER-negative breast cancer stem/progenitor cells〔J〕.J Pharmacol Sci，2016；130(2)：85-93.

7劉旺根，張欽憲，王云龍，等.ER-α36過表達促進人乳腺癌MCF-7細胞侵襲轉移能力〔J〕.基礎醫學與臨床，2013；33(6)：713-7.

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11Soysal SD，Muenst S，Barbie T，etal.EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+)，basal-like，and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer〔J〕.Br J Cancer，2013；108(7)：1480-7.

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15Zheng Y，Qin B，Li F，etal.Clinicopathological significance of Sox2 expression in patients with breast cancer：a meta-analysis〔J〕.Int J Clin Exp Med，2015；8(12)：22382-92.

16Lin CW，Liao MY，Lin WW，etal.Epithelial cell adhesion molecule regulates tumor initiation and tumorigenesis via activating reprogramming factors and epithelial-mesenchymal transition gene expression in colon cancer〔J〕.J Biol Chem，2012；287(47)：39449-59.

17Abd-El-Magsoud M,El-Rehin DM.Clinicopathologic implications of EpCAM and Sox2 expression in breast cancer〔J〕.Clin Breast Cancer，2014；14(1)：e1-9.

〔2017-04-18修回〕

(編輯 袁左鳴)

福建省衛生廳青年科研課題(No.2012-2-77)

張映紅(1958-)，女，主任醫師，主要從事惡性腫瘤規范化診療研究。

李佳藝(1977-)，女，副主任醫師，主要從事惡性腫瘤規范化診治、乳腺癌復發、耐藥機制研究。

R73

A

1005-9202(2017)17-4190-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.009

1 廈門大學附屬第一醫院病理科