雷帕霉素抗神經膠質瘤的活性及其機制

宋和勇 馬春蘭 薛 婷 燕 楠

(青海省第五人民醫院，青海 西寧 810001)

雷帕霉素抗神經膠質瘤的活性及其機制

宋和勇 馬春蘭 薛 婷 燕 楠

(青海省第五人民醫院，青海 西寧 810001)

目的探討雷帕霉素抗神經膠質瘤的腫瘤活性及其相關作用機制。方法MTT細胞毒實驗檢測雷帕霉素對神經膠質瘤細胞C6的生長抑制活性，Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡的發生，PI單染流式細胞儀檢測細胞周期的變化，提取細胞總RNA，RT-PCR檢測survivin mRNA的表達變化，提取細胞總蛋白Western印跡檢測survivin蛋白的表達變化。結果雷帕霉素對神經膠質瘤細胞C6顯示了高效的抗腫瘤活性，IC50值為(8.34±0.62)μmol/L。流式細胞儀凋亡分析顯示0、5、10、20 μmol/L雷帕霉素作用C6細胞48 h后，細胞的凋亡率分別為(3.56%±1.04%)、(13.34%±3.86%)、(22.84%±4.53%)、(51.91%±6.29%)，各組間有統計學差異(P<0.01)。細胞周期分析顯示0、5、10、20 μmol/L雷帕霉素處理C6細胞48h后，細胞增殖指數分別為(64.54%±6.04%)、(50.24%±4.86%)、(39.26%±5.61%)、(30.08%±6.42%)。RT-PCR和Western印跡檢測顯示雷帕霉素可以下調survivin mRNA和蛋白的表達。結論雷帕霉素具有高效的抗神經膠質瘤活性，其作用機制可能與其抑制了mTOR信號通路下調survivin靶蛋白的表達有關。

雷帕霉素；神經膠質瘤；mTOR信號通路；survivin

神經膠質瘤在腦腫瘤中占40%～60%，首選治療方法是手術切除，但手術很難完全切除病灶，因此術后的化療是延緩病變進展的重要措施，同時也是神經膠質瘤標準治療方案的一個重要組成部分〔1〕。膠質瘤的預后很差，約有一半的患者在確診后1年內死亡，約25%的患者會在確診后的兩年內死亡，神經膠質瘤高的死亡率及復發率使其成為預后最差的腫瘤〔2〕。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號通路對人體細胞生長、增殖及細胞周期調節有著重要的作用，相關研究表明其通路的激活與眾多腫瘤的發生、發展密切相關〔3〕。雷帕霉素是mTOR蛋白的抑制劑，其在多種腫瘤中已顯示出抑瘤活性〔4〕，近期的研究顯示mTOR蛋白參與了神經膠質瘤的發生發展，并且與患者的預后也有一定的相關性〔5〕，本研究旨在探討雷帕霉素致神經膠質瘤的凋亡活性及其相關作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 ①青霉素、鏈霉素、雷帕霉素及碘化丙啶(PI)由美國Sigma公司生產；②胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生產；③ RPMI1640培養基由英韋創津公司生產；④ Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒由南京凱基生物科技有限公司生產；⑤ Trizol、RT-PCR試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司生產；⑥ survivin、GAPDH抗體及HRP標記的二抗由美國Santa Cruz公司生產。

1.2膠質瘤細胞系及培養方法 在溫度為37℃及5% CO2條件下，將C6膠質瘤細胞培養于含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100 IU/ml鏈霉素高糖的DMEM培養液中。

1.3膠質瘤細胞生長抑制實驗 將處于對數生長期的C6膠質瘤細胞接種到96孔板(3 000/孔)，待細胞貼壁后即可加入雷帕霉素(對倍稀釋濃度)，在68 h后，加入MTT(0.5 mg/ml)，繼續孵育4 h，然后棄其培養液，再加入DMSO溶解結晶，采用Model 550型酶標儀(Bio-Rad USA)570 nm波長處測定OD值，并計算藥物半數抑制濃度(IC50值)及細胞生長抑制率。

1.4Annexin V/PI雙染法細胞凋亡檢測方法 將處于對數生長期的C6膠質瘤細胞接種到6孔板(0.5×106/孔)，待細胞貼壁后即可加入雷帕霉素(0、5、10、20 μmol/L)處理C6細胞，48 h后，胰酶消化收集細胞且磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次(1 200 r/min離心5 min)，并按照試劑盒的要求加入PI及Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫并避光反應30 min，置冰上等待檢測。采用Cytomics FC500流式細胞儀進行檢測(Beckman Coulter，USA)，其中每個樣品檢測10 000個細胞，如Annexin V陽性和Annexin V與PI雙陽性則為凋亡細胞，由此來計算細胞的凋亡率。

1.5PI單染細胞周期分析 將處于對數生長期的C6膠質瘤細胞接種到6孔板(0.5×106/孔)，待細胞貼壁即可后加入雷帕霉素(0、5、10、20 μmol/L)處理C6細胞，48 h后，胰酶消化收集細胞，PBS洗滌細胞2次，1 200 r/min離心5 min，75%的乙醇固定細胞4～6 h，PBS洗滌細胞2次，加入100 μg/ml碘化丙啶，室溫染色15 min，流式細胞儀檢測 (激發波長488 nm，吸收波長610 nm)收集10 000個細胞，細胞周期分析使用流式細胞儀自帶ModFit LT 3.2 軟件，增殖指數=〔(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M) 〕×100%。

1.6RT-PCR檢測 將本次研究處于對數生長期的C6膠質瘤細胞接種到6孔板(0.5×106/孔)，待細胞貼壁后即可加入雷帕霉素(0、5、10、20 μmol/L)處理C6細胞，48 h后，去上清，PBS洗滌2次，加入Trizol(1 ml)，并依據Trizol說明書指導進行操作，提取細胞總的mRNA，同時依據反轉錄試劑盒說明書進行操作，反轉出cDNA的第一鏈，PCR檢測survinin基因的mRNA表達。Survivin上游引物:5′-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3′，下游引物：5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′；內參照GAPDH基因上游引物：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTT-3′，下游引物：5′-AATGCCAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。反應條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環；72℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠(100 V電壓)電泳45 min后，凝膠成像儀觀察并拍照分析。

1.7Western印跡分析 將處于對數生長期的C6膠質瘤細胞接種到6孔板(0.5×106/孔)，待細胞貼壁后加入即可加入雷帕霉素(0、5、10、20 μmol/L)處理C6細胞，48 h后，去上清并PBS洗滌2次，1×SDS上樣緩沖液裂解細胞，95℃ 10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，在SDS-PAGE 膠(8%積層膠，12%分離膠)電壓80 V電泳分離蛋白，然后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，再將PVDF膜浸潤于TBST(含5%脫脂奶粉)中1 h，并加入survivin蛋白特異性一抗(1∶1 000)在溫度4℃過夜，再次加入HRP標記的二抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h，再加入發光底物X-ray進行曝光顯示目的蛋白條帶，其中GAPDH蛋白作為內參照以顯示相同的上樣量。

1.8統計學方法 應用SPSS18.0軟件行t檢驗、方差分析。

2 結 果

圖1 雷帕霉素對膠質瘤C6細胞survivin表達的影響

2.1雷帕霉素對膠質瘤C6細胞的細胞毒作用 MTT細胞毒實驗顯示在50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78 μmol/L對倍稀釋的雷帕霉素作用下，細胞的生長抑制率分別為(90.87%±7.85%)、(74.28%±5.02%)、(59.78%±4.75%)、(38.94%±5.64%)、(25.80%±4.21%)、(15.06%±2.84%)、(7.53%±3.62%)，由此計算的IC50值為(8.34±0.62)μmol/L。

2.2雷帕霉素對膠質瘤C6細胞的致凋亡作用 流式細胞儀凋亡分析顯示0、5、10、20 μmol/L雷帕霉素處理C6細胞48 h后，細胞的凋亡率分別為(3.56%±1.04%)、(13.34%±3.86%)、(22.84%±4.53%)、(51.91%±6.29%)，雷帕霉素可以劑量依賴性的增加C6細胞的凋亡(P<0.01)。

2.3雷帕霉素對膠質瘤C6細胞細胞周期的影響 PI單染流式細胞儀細胞周期分析顯示0、5、10、20 μmol/L雷帕霉素處理C6細胞48 h后，增殖指數分別為(64.54%±6.04%)、(50.24%±4.86%)、(39.26%±5.61%)、(30.08%±6.42%)，可見雷帕霉素劑量依賴性的抑制了C6細胞的增殖。

2.4雷帕霉素對膠質瘤C6細胞survivin表達的影響 雷帕霉素可以劑量依賴性地下調膠質瘤C6細胞survivin mRNA和蛋白的表達。見圖1。

3 討 論

腫瘤的發生與發展是一個原癌基因和抑癌基因參與的多基因、多因素、多步驟共同作用的結果〔6〕，其中多條信號轉導通路出現調控異常，PI3K/Akt/mTOR信號通路是其中一條重要的致細胞增殖通路，而且最近的研究也發現，該通路可以調控腫瘤干細胞的增殖活性〔9,10〕。腫瘤干細胞是腫瘤內部的一小群起始細胞，是腫瘤產生耐藥和經常復發的根源，可見靶向PI3K/Akt/mTOR信號通路的治療將會有廣闊的臨床應用前景〔9〕。雷帕霉素是臨床廣泛使用的一個免疫抑制劑，其可以抑制T和B淋巴細胞對白細胞介素(IL)-2的反應也可以抑制mTOR的活性調節細胞的生長。

P13K是一個由P85調節亞基和P110催化亞基組成的細胞內第二信使，上游的信號通路激活后磷酸化P85蛋白進而募集P110，催化膜內的PI2K生成PI3K，繼而激活下游的mTOR蛋白，作為重要的一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR可以磷酸化其底物pS6K與4E-BP10YL，并促進蛋白質的翻譯，其中包括一些抗凋亡蛋白〔10〕。本文的凋亡檢測結果表明mTOR蛋白的抑制劑雷帕霉素能夠劑量依賴性地增加神經膠質瘤C6細胞的凋亡比例。mTOR蛋白還可以調控細胞周期，阻止其G1期向S期的過度，本研究也顯示了在雷帕霉素作用下C6細胞阻滯在G1期，細胞增殖指數呈劑量依賴性的減低。

survivin是凋亡蛋白抑制家族(IAP)的新成員，是IAP中迄今發現抗凋亡作用最強的因子，主要通過調節p21抑制caspase-3活化而發揮抗凋亡作用，其在腫瘤細胞內廣泛表達，可見抑制survivin蛋白的表達將會有顯著的致細胞凋亡作用〔11〕。最近的研究顯示survivin的表達受到PI3K/Akt/mTOR信號通路的調控，mTOR可以穩定survivin mRNA，結合其轉錄的起始區域上調蛋白的翻譯〔12〕。本研究結果提示雷帕霉素可以劑量依賴性地下調survivin mRNA和蛋白的表達。

雷帕霉素具有高效的抗神經膠質瘤活性，抑制mTOR信號通路下調survivin靶蛋白的表達可能是其主要的作用機制。

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〔2016-10-20修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)

宋和勇(1973-)，男，副主任藥師，主要從事臨床藥學研究。

R73

A

1005-9202(2017)17-4202-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.014