葉酸對老年冠心病患者外周血內皮祖細胞數(shù)量及功能的影響

陳杰民 涂 昌 程 飛 劉瑞杰 梁逸仙 夏文豪 蘭 軍 潘偉彪

(東莞市第三人民醫(yī)院心內科，廣東 東莞 523326)

葉酸對老年冠心病患者外周血內皮祖細胞數(shù)量及功能的影響

陳杰民 涂 昌 程 飛 劉瑞杰 梁逸仙 夏文豪1蘭 軍 潘偉彪

(東莞市第三人民醫(yī)院心內科，廣東 東莞 523326)

目的探討老年冠心病患者口服葉酸治療對外周血內皮祖細胞(EPCs)數(shù)量及功能的影響。方法選擇初次診斷為冠心病的老年患者60例，隨機分為治療組和對照組，每組30例，在規(guī)范的冠心病二級預防基礎上，治療組給予葉酸5 mg/d口服，對照組口服安慰劑。在入院時、服藥4 w及8 w時檢測兩組患者的同型半胱氨酸(Hcy)和血流介導的內皮舒張功能(FMD)水平，并利用外周血分離單個核細胞進行體外誘導培養(yǎng)，分別觀察其集落形成、增殖及遷移能力。結果DiL-acLDL(紅色)和FITC-UEA-1(綠色)染色雙陽性的細胞可鑒定為EPCs。與對照組比較，治療組治療8 w EPCs數(shù)量、遷移及增殖能力顯著增高〔(67.70±4.09)個vs(48.92±3.55)個，(34.03±3.43)%vs(27.54±4.24)%，(0.67±0.04)%vs(0.54±0.04)%，P<0.05〕，F(xiàn)MD水平顯著增高〔(7.63±1.67)%vs(5.36±1.33)%，P<0.05〕，Hcy水平顯著降低〔(10.37±0.84)μmol/L vs(12.23±0.74)μmol/L，P<0.05〕。EPCs數(shù)量、遷移、增殖能力與Hcy水平呈負相關(r=-0.668,P<0.05;r=-0.657,P<0.05;r=-0.775,P<0.05)，F(xiàn)MD水平與Hcy水平呈負相關(r=-0.718，P<0.05)。結論老年冠心病患者口服葉酸可增高外周血EPCs的數(shù)量、遷移及增殖能力，改善血流介導的FMD，這可能與葉酸降低Hcy水平有關。

冠心病；內皮祖細胞；同型半胱氨酸；葉酸

內皮祖細胞(EPCs)能夠增殖并分化為成熟內皮細胞的前體細胞，參與微血管的新生、損傷血管的修復和內皮功能的維持，在抑制動脈粥樣硬化的進程中發(fā)揮重要的作用〔1〕。EPCs數(shù)量及功能下降與多種因素有關，高同型半胱氨酸(Hcy)血癥在當中發(fā)揮了重要作用，高Hcy血癥可抑制EPCs的增殖、遷移和存活，延緩血管內皮的修復〔2〕。葉酸是Hcy代謝過程中的輔酶，其缺乏可引起血漿中Hcy升高，補充葉酸已被證實可有效降低老年患者血漿Hcy水平〔3〕，但是否對EPCs的數(shù)量以及功能產生影響，目前國內外的報道較少。本研究通過觀察老年冠心病患者在口服葉酸前后外周血EPCs的數(shù)量及功能的變化，探討補充葉酸對老年冠心病患者可能的獲益。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年7月至2014年6在東莞市第三人民醫(yī)院心內科收治的初次診斷為冠心病的老年患者60例，男36例，女24例，年齡60～75〔平均(67.37±3.95)〕歲，所有患者經冠狀動脈造影或冠狀動脈CT血管造影(CTA)檢查，任何一支冠狀動脈主要分支狹窄≥50%診斷為冠心病。隨機將患者分為治療組和對照組，每組30例。按規(guī)范的冠心病二級預防方案給予阿司匹林、β受體阻滯劑和他汀類藥物。在此基礎上，治療組給予葉酸5 mg/d口服，對照組口服安慰劑。所有受試對象均排除腫瘤、感染、自身免疫性疾病、嚴重肝腎功能不全等疾病。此研究符合人體試驗委員會制定的倫理標準，所有患者均同意加入研究并簽署知情同意書。兩組患者男性比例、高血壓、糖尿病、吸煙史、年齡、空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2方法

表1 兩組人群基礎指標比較

1.2.1基線數(shù)據檢測 受試對象均詳細詢問病史，記錄年齡和吸煙史，測量并記錄血壓，檢測各項生化指標，常規(guī)檢查胸部X線、心電圖、心臟彩色超聲和腹部B超，排除腫瘤等其他疾患。入院時、服藥4、8 w時檢測患者的Hcy和血流介導的內皮舒張功能(FMD)水平，并利用外周血分離單個核細胞進行體外誘導培養(yǎng)，分別觀察其集落形成、增殖及遷移能力。

1.2.2FMD測定 患者取仰臥位，充分暴露左上臂，使用7.5 MHz的超聲探頭(飛利浦IE33超聲心動圖儀)進行檢測。探頭放置于左側肘窩上方3～5 cm處，充分顯示肱動脈的長軸二維圖像，取得最佳直線動脈血液界面和最大肱動脈內徑。首先測定基礎的肱動脈內徑，然后將血壓計的袖帶綁在左側肘部，充氣并加壓至200 mmHg，加壓4 min后迅速放氣減壓，放氣60～90 s內再次測定肱動脈內徑。FMD值以充血后反應性的肱動脈內徑和基礎的肱動脈內徑之間變化的百分比表示。

1.2.3EPCs培養(yǎng)與鑒定 抽取患者的外周血20 ml，使用密度梯度離心法獲得單個核細胞。將細胞貼壁培養(yǎng)7 d后，加入0.02 mg/ml的DiI-acLDL溶液(采購自美國Molecular Probe公司)，在37℃下孵育2 h；用磷酸鹽緩沖液沖洗2次，然后加入4%多聚甲醛溶液固定細胞15 min，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗2次。完成上述步驟后，加入0.01 mg/ml的FITC-UEA-1溶液(采購自美國Sigma公司)，37℃下孵育1 h；加入10 μg/ml的二脒基苯基吲哚溶液，37℃下孵育5 min。最后，使用熒光倒置顯微鏡進行觀察，DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙染色陽性細胞為EPCs。EPCs培養(yǎng)第7天后，在40倍顯微鏡鏡下隨機選取3個視野進行細胞計數(shù)，取平均值。

1.2.4EPCs遷移能力檢測 首先在改良Boyden小室下室加入含有50 ng/ml血管內皮生長因子的杜氏培養(yǎng)液，然后使用2.5 g/L的胰酶消化貼壁細胞，并將細胞懸浮于杜氏培養(yǎng)液中。將含1×105個懸浮細胞的杜氏培養(yǎng)液500 μl注入上室進行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后去除濾膜上的未遷移細胞，然后使用甲醇進行固定，Giemsa 溶液進行染色，在400倍顯微鏡鏡下隨機選3個視野對遷移細胞進行計數(shù)，取平均值。

1.2.5EPCs增殖能力檢測 EPCs培養(yǎng)7 d后，首先使用2.5 g/L的胰蛋白酶消化貼壁細胞，并將細胞懸浮于杜氏培養(yǎng)液中，然后將細胞接種到使用人纖維連接蛋白包被的96孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)板上每孔加入10 μl噻唑藍(5 g/L)。經過4 h的培養(yǎng)后，首先去除上清液，然后在培養(yǎng)板上每孔加入150 μl二甲基亞砜，充分搖勻，10 min后使用酶標儀下在波長490 nm處檢測吸光度值。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，χ2檢驗，直線相關分析。

2 結 果

2.1EPCs鑒定 DiL-acLDL(紅色)和FITC-UEA-1(綠色)染色雙陽性細胞鑒定為EPCs。見圖1。

2.2兩組治療后Hcy水平，EPCs數(shù)量、增殖、遷移能力以及FMD比較 與對照組比較，治療組EPCs數(shù)量、遷移及增殖能力及FMD顯著增高，Hcy水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3EPCs數(shù)量、遷移、增殖能力與內皮舒張功能與Hcy水平的相關性 葉酸治療8 w后，EPCs數(shù)量、遷移、增殖能力與Hcy水平呈負相關(r=-0.668,P<0.05;r=-0.657,P<0.05;r=-0.775,P<0.05)，F(xiàn)MD水平與Hcy水平呈負相關(r=-0.718，P<0.05)。

DiI-acLDL(紅色)

FITC-UEA-1(綠色)

雙染色陽性細胞

表2 兩組治療后Hcy水平和EPCs數(shù)量、增殖、遷移能力及FMD比較

與對照組同時點比較:1)P<0.05

3 討 論

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在冠心病患者中，EPCs數(shù)量明顯降低，且患者的內皮功能與EPCs數(shù)量呈負相關〔4〕。EPCs數(shù)量及功能下降與多種因素有關，在中國老年患者中較為常見的高Hcy血癥在當中發(fā)揮了重要作用。Veeranna等〔5〕發(fā)現(xiàn)，高Hcy血癥可抑制EPCs的增殖、遷移和存活，延緩血管內皮的修復，與動脈粥樣硬化相關；Huang等〔2〕的研究也發(fā)現(xiàn)冠心病患者的EPCs與Hcy水平相關。年齡是影響Hcy水平的一個重要因素，可能的原因包括老年人群的食欲普遍減退，消化系統(tǒng)功能較年輕時有所下降，導致葉酸等營養(yǎng)素攝入減少；同時，體內與Hcy代謝相關的酶活性下降，導致Hcy難以降解；此外，腎功能下降導致Hcy排泄減少亦可導致Hcy在體內的水平升高。目前已知補充葉酸是降低體內Hcy的安全和有效的方法。本研究可以證實，老年冠心病患者口服葉酸可改善外周血EPCs的數(shù)量及功能，與此同時患者的Hcy水平明顯下降，由此可以推測，EPC的數(shù)量與功能改善可能與Hcy水平降低有關。

此外，葉酸對內皮功能的保護也可能與其他因素有關。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，葉酸可通過降低氧化應激改善冠心病患者的內皮功能，且這種作用并不依賴于Hcy的降低〔6〕。四氫生物蝶呤是內皮型一氧化氮合酶的必要的輔助因子，四氫生物蝶呤缺乏導致一氧化氮合酶脫耦聯(lián)，氧化應激的激活可損害血管的內皮功能，同時促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。葉酸是四氧生物蝶呤系類似物，并有抗氧化的作用。外源性補充葉酸可以通過提高四氫生物蝶呤的水平、抗氧化應激等途徑改善內皮功能，阻斷動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，這種作用獨立于其對Hcy水平的影響。

另外，也可能存在葉酸與冠心病二級預防藥物的協(xié)同效應，調脂藥物如他汀類藥物〔7〕可導致EPC數(shù)量及活性增加。總之，內皮功能障礙的本質是內皮損傷和修復之間的動態(tài)平衡的破壞，EPCs在維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)定狀態(tài)中起著重要作用。本研究結果顯示，葉酸可以改善老年性冠心病患者外周血EPCs的數(shù)量及其活性，從而為臨床補充葉酸改善血管內皮功能提供了一定的理論依據。本研究也存在不足，如缺乏遠期臨床預后的數(shù)據，研究結果的臨床意義有待進一步明確。葉酸價格低廉，口服方便，無明顯副作用，尤其適合老年患者。因此，補充葉酸對治療老年冠心病無疑很有前景。

1Ali ZA，Rinza R，Douglas G，etal.Tetrahydrobiopterin determines vascular remodeling through enhanced endothelial cell survival and regeneration〔J〕.Circulation，2013；10：S50-8.

2Huang C，Zhang L，Pan H，etal.Endothelial progenitor cells are associated with homocysteine in coronary artery disease〔J〕.Acta Cardiol，2011；66(6)：773-7.

3Anderson CA，Jee SH，Charleston J，etal.Effects of folic acid supplementation on serum folate and plasma homocysteine concentrations in older adults：a dose-response trial〔J〕.Am J Epidemiol，2010；172(8)：932-41.

4涂 昌，蘭 軍，粱逸仙，等.藥物洗脫支架對老年性急性冠狀動脈綜合征患者內皮祖細胞的影響〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2012；14(9)：918-20.

5Veeranna T，Zalawadiya SK，Niraj A，etal.Homocysteine and reclassification of cardiovascular disease risk〔J〕.J Am Coll Cardiol，2011；58(10)：1025-33.

6程 飛，潘偉彪，蘭 軍，等.口服葉酸輔助治療冠心病的臨床研究〔J〕.中國動脈硬化雜志，2014；22(5)：498-501.

7Bao XM，Wu CF，Lu GP，etal.Atorvastatin inhibits homocysteine-induced dysfunction and apoptosis in endothelial progenitor cells〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2010；31(4)：476-84.

〔2016-05-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

廣東省醫(yī)學科研基金(No.A2011722)；廣東省科技廳社會引導發(fā)展項目(No.2011B031800011)

涂 昌(1973-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事冠心病基礎與臨床研究。

陳杰民(1979-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病的介入診療研究。

R543.3

A

1005-9202(2017)17-4216-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.022

1 中山大學附屬第一醫(yī)院心內科