水體常見喹諾酮類抗生素對發光菌的毒性作用

高瑋岐++董玉瑛++汪皓琦++鄒學軍

摘要：以明亮發光桿菌（Photobacterium phosphoreum）為受試生物，研究3種水體常見的喹諾酮類抗生素（QNs）對其的單一毒性和聯合毒性作用，并基于毒性單位法、相加指數法和混合毒性指數法等聯合作用評價方法，對混合體系的聯合毒性作用類型進行分析。結果表明，不同的評價方法對3種QNs的聯合效應評價結果具有較好的一致性，聯合毒性作用類型均表現為不同程度的拮抗作用。根據發光菌發光原理和QNs分子結構不同，可對聯合毒性作用的機理進行初步探討。多種QNs混合體系的聯合毒性作用呈現出以拮抗效應為主，揭示了此類醫藥品在環境中聯合使用時可導致藥效的降低或引發微生物耐藥性的傳播。

關鍵詞：單一毒性；聯合毒性；明亮發光桿菌（Photobacterium phosphoreum）；喹諾酮類抗生素；評價

中圖分類號：X503.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）16-3074-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.018

The Toxicity of the Common Quinolones in Water Body to Photobacterium phosphoreum

GAO Wei-qi， DONG Yu-ying， WANG Hao-qi， ZOU Xue-jun

（College of Environment and Resource，Dalian Nationalities University， Dalian 116600，Liaoning，China）

Abstract： The single toxicity and joint toxicity of three quinolones common detected in the aquatic environment were studied on Photobacterium phosphoreum. The joint toxicity was evaluated by toxicity unit，additive index and mixtures toxicity index. The results of three evaluating methods had good consistency. It suggested that the antagonisms of various extents appeared among the mixture systems. Mechanisms of joint toxicity were preliminary analyzed by luminescence principle of P. phosphoreum and the characteristics of quinolones molecular structure. The facts that mixture systems showed almost antagonism could reveal that joint toxicity in the environment may increase pharmaceutical action or induce the spread of antibiotic resistance.

Key words： single toxicity； joint toxicity； Photobacterium phosphoreum； quinolones； evaluation

喹諾酮類抗生素（QNs）在治療人和動物細菌性感染方面具有良好的臨床效果，應用廣泛，其需求及使用量大，據統計，2010年氟喹諾酮類藥物占據全球抗生素15%的市場份額[1]，而抗生素進入人或動物體內后40%～90%以母體或代謝物的形式隨排泄物進入環境[2]，其環境殘留對水生生物、植物生長發育等產生明顯的危害或潛在的負面影響，當前水體已成為環境中抗生素重要的歸宿地，多種QNs具有較高的檢出水平[3-5]。環境中抗生素的暴露特征體現在混合、持久和低劑量等方面，因其產生的聯合毒性對水生生物及水環境系統會帶來很大風險[6]。單一QNs的生物學效應研究顯然不能滿足現實中水體的特點，QNs生態毒性機理的研究以及與其他環境污染物的聯合毒性效應值得重視[7，8]。

結合生物發光細菌應用范圍廣、靈敏度高、相關性好、反應速度快等優點[9]，本試驗以加替沙星、洛美沙星和左氧氟沙星3種喹諾酮類抗生素為研究對象，將明亮發光桿菌（Photobacterium phosphoreum）作為指示物，測定3種抗生素對發光菌發光抑制的半數效應濃度（EC50）和不同混合體系的EC50，并采用毒性單位法、相加指數法、混合毒性指數法等聯合毒性評價方法對聯合毒性作用類型進行評價。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

加替沙星片和鹽酸左氧氟沙星膠囊（江蘇蘇中藥業集團股份有限公司）、鹽酸洛美沙星片（江蘇黃河藥業股份有限公司），用3%NaCl溶液配制相應的系列濃度梯度，待用。試驗所用試劑均為分析純。

DXY22型生物毒性測試儀（中國科學院南京土壤研究所）、8522型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）、THZ282氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇儀器廠）、DHP29082型電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）、LDZX240CI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）、不同量程的精密移液器（Thermo公司）、SJH型潔凈工作臺（沈陽市凈化儀器廠二分廠）、常規玻璃儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的培養 工作菌液的制備：吸取一定量培養好的搖瓶菌液于3%NaCl溶液中，充分攪拌，稀釋程度以控制空白（由2 mL的3%NaCl溶液和0.1 mL的工作菌液組成）發光強度在300～800 lx為宜。明亮發光桿菌凍干粉購自中國科學院南京土壤研究所微生物室。有關發光菌凍干粉的復蘇、斜面菌種的培養、搖瓶菌液的培養、工作菌液的制備等操作方法見文獻[10]。endprint

1.2.2 急性毒性EC50的測定 ①預試驗。選定濃度梯度進行試驗，觀察15 min發光菌的發光抑制率，確定試驗濃度范圍。②單一毒性EC50的測定。在預試驗基礎上，將待測化合物配成適當的6個濃度梯度，各取不同梯度的溶液2 mL加入具塞磨口比色管（15 cm，H 6 cm）中，以2 mL 3%NaCl溶液作空白對照，取0.2 mL工作菌液于各比色管中，加塞上下振蕩均勻，去塞，暴露15 min，測定發光強度。每個濃度梯度設3組平行，保證標準偏差低于10%。③聯合毒性EC50的測定。按等濃度比（mg/L）配制加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星的二元及三元混合體系，根據預試驗結果設6個濃度梯度（半數抑制率附近），測定混合體系對發光菌的聯合毒性EC50，試驗步驟與單一毒性EC50測定相同，控制3組平行的試驗標準偏差低于10%。

1.2.3 數據處理 鑒于污染物濃度與其對應發光抑制率的關系在EC50附近呈良好的線性分布，故本試驗采用Excel繪圖軟件，將化合物濃度（x）和相對抑制率（y）進行回歸分析，求得線性回歸方程，y（發光抑制率）=ax（化合物濃度）+b。根據線性回歸方程求出發光抑制率為50%時所對應的化合物濃度，即為化合物單獨作用時EC50。化合物濃度和死亡率之間的相關系數R，經顯著水平檢驗，置信區間范圍大于95%；反之，需重新測定。

發光抑制率=×100%

1.2.4 聯合毒性評價方法 當多種有害因素危害機體時，可以產生獨立、相加、協同和拮抗4種作用類型。常用于聯合毒性評價的方法有毒性單位法、相加指數法、混合毒性指數法等[11]。各類評價指數的評價標準見表1。

2 結果與分析

2.1 單一毒性作用分析

3種QNs（加替沙星、左氧氟沙星和洛美沙星）對發光細菌的急性毒性測試曲線見圖1。曲線表征的是典型的毒性濃度—效應關系，其效應關系較為清晰，從圖1可以看出，3種醫藥品對發光菌發光強度的抑制曲線均呈單調非線性遞增趨勢。

3種化合物加替沙星、洛美沙星和左氧氟沙星對發光菌有不同程度的抑制作用，EC50分別為8.4×10-5、13.7×10-5和12.9×10-5 mol/L。根據其EC50的大小，判斷抑制作用強弱為加替沙星>左氧氟沙星>洛美沙星，即加替沙星的生物毒性最大，環境風險也最大，以下依次是左氧氟沙星和洛美沙星。從結構上看，3種QNs母環相同，各自取代基的種類和數量皆不同，可見影響醫藥品毒性的因素來源于取代基。翟麗華[12]選取17個部分取代苯化合物對發光菌的急性毒性研究得出取代基對發光菌的毒性貢獻大小順序為-NO2>-Cl>-CH3>-NH2>-OH。李曉等[13]研究10種苯并噻唑類污染物對青?；【鶴67毒性效應得出各取代基對青?；【拘耘判驗閹€基取代>氨基>2羥苯基>羧酸乙酯>溴>氟>甲基>氯>甲硫基>苯并噻唑。上述試驗結論均是在各同系物取代基單一的情況下取得，對本試驗有借鑒參照的意義。如需獲得各取代基對藥物的毒性貢獻則需要對更多相關試驗結果加以分析及分子相互作用機制的理論支持。

2.2 二元混合體系聯合毒性分析

將3種化合物按等毒性比例配成二元混合體系，其混合體系的聯合毒性作用見表2。由表2可知，等毒性比例混合時，3組二元混合體系均表現出拮抗作用。根據3組二元混合體系的MTI和AI的不同，可判斷其拮抗作用的強度有所不同，由此獲得不同體系拮抗作用的排序為加替沙星+洛美沙星﹥加替沙星+左氧氟沙星﹥左氧氟沙星+洛美沙星。

2.3 三元混合體系聯合毒性分析

將3種化合物按等毒性比例配成三元混合體系，其混合體系對發光菌的EC50及聯合毒性作用類型見表3。二元混合體系聯合毒性類型均表現為拮抗作用，由此分析，3種喹諾酮類抗生素分子間的相互作用導致體系聯合毒性降低，多個二元拮抗體系累加，分子間相互作用增強，導致多元混合體系呈拮抗作用。由表3可知，等毒性比例混合時，三元混合體系表現出拮抗作用，且拮抗作用較強，試驗結果符合分析，多元混合體系聯合毒性作用類型表現為拮抗效應是各拮抗體系累加的結果。方章順等[14]研究典型抗生素與群體感應抑制劑對費氏弧菌的三元慢性聯合毒性時證明混合體系為拮抗效應，是其中兩個較強的拮抗體系疊加的結果。任皓等[15]研究鹽酸吉他霉素與金霉素、鹽霉素、黃霉素對發光細菌聯合毒性作用時，在多個混合體系得到相似結論，表明體系中拮抗作用表現較強的分子混合體系起主導作用。此外試驗得多元混合體系均表現為拮抗作用，可見醫藥品在環境中，經過各途徑混合后，其相互作用可能導致毒性減弱，以及微生物耐藥性的產生和傳播，致使微生態平衡遭到破壞。

3種評價方法對二元或多元混合體系的聯合毒性評價結論一致，均為拮抗作用，表明3種評價方法具有良好的一致性，其中相加指數法所得數值絕對值最大，參數物理意義較明確，評價結果便于理解。孟慶俊等[11]對苯胺及硝基苯胺的二元混合體系運用毒性單位法、相加指數法、混合毒性指數法等進行聯合毒性的評價，結果具有良好的一致性，均為較強的拮抗作用。董玉瑛等[10]采用毒性單位法、加和指數法、混合毒性指數法和相似性參數法4種評價方法對SDS、苯酚、甲苯、硝基苯的多元混合體系進行聯合毒性作用類型評價，結果較為一致，均為協同作用，且聯合毒性強弱評價結果呈現出一致的順序。

2.4 毒性作用機制的初步探討

二元及三元混合體系聯合毒性作用皆為拮抗效應，對于呈現的聯合毒性作用效應，可從喹諾酮類抗生素不同取代基的特性及其相互作用、發光桿菌發光原理進行初步的聯合毒性機理分析。

大部分發光細菌發光機制是基本相同的，都必須有細菌熒光素酶（LE）、還原性的黃素單核苷酸（FMNH2）、氧氣（O2）、長鏈脂肪醛（RCHO）的參與，大體發光反應過程如下[10]：

試驗中3種藥品存在較大電負性、含孤電子對的元素（F、O、N），他們所在的基團氨基（-NH2）、羥基（-OH）等都易與黃素單核苷酸結合形成氫鍵，阻礙或阻止FMNH2在氧化和還原形式之間的氫傳遞，抑制發光[10]。結合本試驗3種QNs聯合毒性作用類型，拮抗作用引起發光桿菌發光變化是由于在反應中，還原態的黃素單核甘酸（FMNH2）被氧化成黃素單核甘酸（FMN）的過程中起到了傳遞氫的作用，加替沙星、洛美沙星和左氧氟沙星的分子中均含有N元素，對于FMNH2而言是一種營養元素，可在一定程度上促進氫的傳遞，進而降低發光的抑制程度，表現為拮抗作用。進一步結論還需要對藥物聯合毒性作用機制以及發光菌生理生化反應等進行深入研究。在此基礎上可開展QNs四元及以上多元混合體系的聯合毒性作用類型的研究，同時運用建模等手段輔助研究。endprint

3 小結

本試驗主要研究了3種QNs對發光菌的急性單一及聯合毒性。①3種QNs單一毒性由強到弱的順序依次為加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星。由此推斷其單一毒性可能與其化學結構有關。②二元、三元體系QNs聯合毒性皆呈現出不同程度的拮抗作用，此類醫藥品在環境中的聯合使用可能導致混合毒性減弱，造成微生物耐藥性的產生和傳播，影響微生態的平衡。③3種評價方法表現出良好的一致性，都是評價聯合毒性可行的方法，其中以相加指數法獲得參數絕對值較直觀，判定靈敏度較高。

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