白術種苗的無性快速繁殖技術研究

李紅英++覃大吉++陳菲菲++楊永康++李亞杰

摘要：以白術（Atractylodes macrocephala Koidz.）的腋芽為外植體，以不同的光照時間、光照度和植物生長調節劑6-BA、NAA不同濃度配比以及MS、1/2 MS、1/4 MS培養基分別進行初代培養、愈傷組織誘導培養、愈傷組織增殖培養、愈傷組織叢生芽誘導培養、叢生芽生根培養，并煉苗移栽。結果表明，愈傷組織誘導培養基1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA的愈傷組織形成率為97.2%；愈傷組織增殖培養基MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA的愈傷組織增殖能力為9.5倍；愈傷組織叢生芽誘導培養基1/2 MS+1.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的愈傷組織叢生芽誘導倍數為4.5倍；生根培養基1/4 MS+0.75 mg/L NAA的生根率為96.7%，生根平均數為8.2條/芽，煉苗移栽的成活率在91.5%～93.0%。通過該方法進行白術種苗繁殖，有利于向國家作物種質資源庫輸送優質種質資源材料，豐富白術基因庫，便于白術優質種質資源的交流與共享，從而提高育種水平與藥材生產能力。

關鍵詞：白術（Atractylodes macrocephala Koidz.）；腋芽；愈傷組織培養；快速繁殖

中圖分類號：Q949.778.4-61 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）16-3110-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.028

Research on Fast Asexual Propagation Technology of Atractylodes Seedling

LI Hong-ying1，2，3，QIN Da-ji1，2，CHEN Fei-fei1，2，YANG Yong-kang2，LI Ya-jie1

（1. West Comprehensive Experiment Station of Hubei Provincial Agriculture Science and Technology Innovation Center， Enshi 445000， Hubei， China； 2. Enshi Qingjiang Bio-Engineering Co.，Ltd.， Enshi 445000， Hubei， China； 3. College of Food Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： Large-headed atractylodes（Atractylodes macrocephala Koidz.） axillary bud is used as explant， which is treated with different time and intensity of illumination， different concentration of 6-BA and NAA on MS， 1/2 MS，1/4 MS culture medium for original culture， callus induction culture， cultivating callus proliferation， induction of callus growing cultivation， multiple shoot clumps， rooting and seedling transplanting to find out the optimum fast asexual propagation technology. When callus induction media is 1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA， the callus formation rate is 97.2%. When callus proliferation medium is MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA， callus proliferation ratio is 9.5 times. When induction of callus growing medium is 1/2 MS+1.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA. When rooting medium is 1/4 MS+0.75 mg/L NAA， the rooting rate is 96.7%； the rooting ratio is 8.2 times； and seedling transplanting survival rate is 91.5%～93.0%. Atractylodes seedling breeding is beneficial to transfer high quality germplasm resources to the national crop germplasm bank， rich the atractylodes seed gene pool and facilitate atractylodes quality germplasm resource exchange and sharing， improve the level of breeding and medicinal material production level.

Key words： atractylodes（Atractylodes macrocephala Koidz.）； axillary bud； callus culture； rapid propagationendprint

白術（Atractylodes macrocephala Koidz.）為菊科（Compositae）蒼術屬（Atractylodes DC.）多年生草本植物，又名于術、浙術、冬術等，為中國傳統藥用植物，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎等功效[1]。近年來研究表明，白術有利尿、抗腫瘤、抗菌消炎、抗糖尿病、抗衰老等作用[2-4]。而且還含有許多具有藥理活性的化合物[5]。由于白術用途廣泛，市場需求量大，全國各地皆有種植。但白術生產中存在品種退化、類型混雜、藥材質量和產量均下降、有效成分含量不穩定等問題，市場需求無法得到滿足。為了改善這一現狀，課題組采用咸豐縣生產上表現好的白術田間類型Ⅱ[6]，經過4～5代的選優得到的植株腋芽，通過組織培養快速繁殖和提純復壯，選擇遺傳性狀穩定、繁殖系數顯著提高、成本顯著降低、藥材質量和產量較高的優系，從而豐富白術基因庫，促進白術藥用次生代謝產物的研究與開發[7-9]。通過以白術腋芽為外植體進行快速繁殖，進一步提高藥用植物的育種水平與藥材生產能力。為中藥材生產上快速示范推廣提供批量的優質種苗。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料來源于咸豐縣白術品種選育基地，在2015年4月，選取生產上表現良好的類型、經培育4～5代的二年生白術種苗。植物生長調節劑有6-BA、NAA。

1.2 培養方法

1.2.1 初代培養 選擇優良單株健壯、幼嫩的腋芽，修剪多余的葉片，先用清水沖洗1 h以上；在超凈工作臺上進行外植體的表面滅菌，先使用75%的酒精浸泡50 s，后使用去離子水沖洗4～5次，然后用0.1%的氯化汞溶液浸泡60 s，再用去離子水沖洗3～4次，最后用5%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，期間不斷攪拌，再去離子水沖洗4次，倒出多余的去離子水，將腋芽放置培養皿中，待用。剪去無菌處理過的白術腋芽受傷的部位，將其接種于1/2 MS、pH 5.8～6.0初代培養基中，培養環境光照時間10～20 h/d、光照度1 500～2 000 lx。接種6～7 d后觀察腋芽生長情況。

1.2.2 愈傷組織誘導培養基篩選 培養20 d待苗長到3～5 cm左右后，于超凈工作臺上將初代培養苗從培養瓶中取出，置于無菌培養皿中，用高壓滅菌后的醫用鑷子、醫用剪刀修剪腋芽后轉接到愈傷組織誘導培養基中，愈傷組織誘導培養基為1/2 MS+ 0.5～1.0 mg/L 6-BA+0.1～0.5 mg/L NAA，培養環境光照時間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，接種30 d后統計培養結果。

1.2.3 愈傷組織增殖培養基篩選 在超凈工作臺上將誘導出的愈傷組織用滅菌鑷子拿出，放到無菌培養皿中，用剪刀除去表面的培養基，接種到增殖培養基中，增殖培養基為MS+0.5～1.5 mg/L 6-BA+0.5～1.5 mg/L NAA，培養環境光照時間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，接種45 d后統計培養結果。

1.2.4 愈傷組織叢生芽誘導培養基篩選 在超凈工作臺上，將培養到2～4 cm的愈傷組織用滅菌鑷子拿出，放到無菌培養皿中，用剪刀切成直徑0.3 cm的小塊，按5塊/瓶接種于愈傷組織叢生芽誘導培養基中，叢生芽誘導培養基為1/2 MS+1.5～2.0 mg/L 6-BA+0.1～0.5 mg/L NAA，pH 5.8～6.0，培養環境光照時間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，選擇最佳培養愈傷組織叢生芽誘導培養基。

1.2.5 叢生芽生根培養 在超凈工作臺上，將培養后長到2 cm左右的白術叢生芽剪切，按3芽/瓶“品字形”排列轉接到生根培養基中，生根培養基為1/4 MS+0.1～1.0 mg/L NAA，培養環境光照時間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，培養30 d后觀察培養結果。

1.3 煉苗移栽

當白術組培苗根長長到2 cm左右時，將培養瓶從組培室移出，置于煉苗室常溫閉瓶煉苗3 d，然后旋松蓋子2 d、全開蓋2 d；煉苗完成后，將白術苗從培養瓶中移出，放入清水盆中，小心洗去根部瓊脂，然后撈出，移栽至基質為泥炭土的苗圃中，澆透水，每天早晚清水噴灑葉面保濕，5 d后減少噴水次數；然后每5 d澆灌1次低濃度營養液，營養液為1/2 MS大量元素、微量元素、鐵鹽等，15 d后統計成活率。

2 結果與分析

2.1 白術腋芽愈傷組織誘導與增殖

白術腋芽愈傷組織誘導培養結果見表1，愈傷組織增殖培養結果見表2。在試驗過程中，腋芽誘導培養7～15 d后，觀察到腋芽開始有愈傷組織形成；腋芽愈傷組織增殖培養5～7 d后，觀察到白術愈傷組織開始生長，每個培養周期45 d。由表1、表2可知，白術腋芽愈傷組織培養的誘導率與增殖倍數受植物生長調節劑6-BA、NAA的影響較為明顯，愈傷組織直徑平均增殖5.2～9.5倍，其中1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA、MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA分別為白術腋芽愈傷組織誘導與增殖較為理想的培養基。

2.2 白術愈傷組織叢生芽誘導

白術腋芽愈傷組織叢生芽誘導培養結果見表3。試驗觀察到誘導培養6～10 d后，白術愈傷組織芽開始生長，20 d后平均生芽數為3～4個/塊、15～20個/瓶。從表3可知，隨著植物生長調節劑6-BA、NAA濃度的增大，誘導率也隨之增大，但到一定范圍后隨著植物生長調節劑濃度的增大，誘導率又降低。因此，1/2 MS+1.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為白術腋芽愈傷組織叢生芽誘導較為理想的培養基。

2.3 白術苗生根與移栽

將培養后芽長到2 cm左右的白術叢生芽剪切，按3芽/瓶“品字形”排列轉接到生根培養基中培養，結果見表4。試驗觀察到，生根培養8～14 d后有根和芽生長；從表4可見，培養30 d后，平均生根數為 4～5條/芽、12～15條/瓶。說明NAA能促進白術試管苗的生根，但是濃度高低差異明顯，生根效果以0.75 mg/L NAA較佳；濃度若再高，根容易產生畸形，而過低則生根率偏低，生根較為理想的培養基為1/4 MS+0.75 mg/L NAA。在煉苗移栽后15 d，統計成活率為91.5%～93.0%。endprint

3 討論

1）白術腋芽為優異的外植體，通過無性繁殖，生長速度快，可以保持母體遺傳的穩定性，使遺傳過程得以控制，獲得優良后代，并得以保存。

2）植物生長調節劑6-BA、NAA能共同快速促進白術愈傷組織形成與增殖培養，一個周期能增加上千倍的植株，繁殖速度快、污染少，同時大大縮短了植物生長周期，擴大了群體數量，有利于對育種過程中出現的優異中間材料進行保存與評價，并加以利用。

3）白術愈傷組織叢生芽誘導率最高達95.9%，成活率91.5%～93.0%，并沒有產生變異，克服了種子繁殖后代性狀嚴重分離的現象，縮短了白術品種選育年限。

4）植物生長調節劑NAA能促進白術試管苗根的生長，大約在移栽8 d后生根，并且根系生長發達旺盛；不過在濃度過低時生長緩慢，過高則有部分網狀根出現，影響了試管苗的生長質量。

參考文獻：

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