DNA甲基化在肌萎縮側索硬化發病機制中的研究進展

吳成斯 徐仁伵

(南昌大學第一附屬醫院，江西 南昌 330006)

·綜述·

DNA甲基化在肌萎縮側索硬化發病機制中的研究進展

吳成斯 徐仁伵

(南昌大學第一附屬醫院，江西 南昌 330006)

肌萎縮側索硬化；表觀遺傳學；DNA甲基化

肌萎縮側索硬化(ALS)是一種進行性、復雜性神經系統變性病，確切機制不明。ALS 發病人群中5%～10%為家族性ALS，大多數為散發性病例。家族性青年型ALS 遺傳方式為常染色體顯性或隱性遺傳，成年型為常染色體顯性遺傳，但可有外顯不全現象；部分家系中不同的ALS 患者顯示有不完全同型的發病年齡及臨床表型〔1〕。這說明遺傳因素在ALS 發病中起了一定作用，但遺傳因素并不能詮釋所有的ALS。近年研究表明，除了免疫因素、慢病毒感染、中毒因素等外，環境因素在ALS 的發病中也起了重要作用〔2〕。然而目前發現由單純的基因序列變異或環境毒物暴露所致的ALS 是極少的。因此，ALS 作為一種復雜性疾病，遺傳因素與環境因素在其發生發展過程中均起了重要作用。但共同的作用機制尚不明確，而表觀遺傳學可能是遺傳和環境因素相互作用的橋梁〔3〕。

表觀遺傳學(Epigenetics)是在不涉及 DNA 序列改變的情況下，通過基因組DNA 和組蛋白的化學修飾、RNA干擾、蛋白質與蛋白質相互作用、DNA 和其他分子的相互作用等影響來調節基因的功能和特征，并能遺傳給后代。在一項關于雙胞胎的不一致研究中發現，即使作為一對同卵雙生型雙胞胎，兩者的表觀遺傳特征也存在差異。Fraga等〔4〕發現，擁有相同基因型的雙胞胎在一些神經變性疾病中會表現出不同的外顯率。表觀遺傳修飾逐漸被認為是導致很多復雜性疾病的機制之一〔5〕。在表觀遺傳修飾的各種類型中，DNA甲基化是最重要的發現，并被廣泛研究。DNA甲基化的異常被認為參與了很多人類疾病的發病，包括腫瘤和神經變性疾病。近來，大量數據指出DNA甲基化與神經變性疾病之間存在非孟德爾遺傳規律的共同特點。本文就DNA甲基化在ALS發病機制中的研究做一綜述，首先概述DNA甲基化的概念，然后主要闡述近年來DNA甲基化在ALS發病機制中的研究。探討DNA甲基化與ALS發病的相關性，從而進一步了解DNA甲基化在ALS發生的中原因及作用機制。

1 DNA甲基化

作為表觀遺傳學最為重要的機制之一，DNA甲基化幾乎特有地發生在胞嘧啶堿基上。甲基基團常常被轉移到位于胞嘧啶的5位碳原子上。被甲基化的胞嘧啶常位于基因序列中5′→3′方向緊隨相連的CG堿基中，這一特定二核苷酸被記為CpG，富含CpG的區域被稱為CpG島。在人類和其他哺乳動物中，CpG島常位于轉錄調控區附近，即5′端結構基因啟動子的核心序列和轉錄起始點。基因沉默往往與這一區域的甲基化相關。在啟動子區域，5-甲基胞嘧啶(5mC)修飾使得染色質重組，通過結合轉錄因子或提供轉錄抑制因子結合位點的相互作用，實現與基因表達沉默相關的調節〔6〕。而內含子區5mC修飾常常導致基因激活〔7〕。

大部分時候CpG島并不被甲基化，除了特殊功能外，如X染色體的失活才有CpG島的甲基化。相反，位于重復序列或絲粒序列中非CpG島序列的CpG二核苷酸往往容易發生甲基化〔8〕。基因組中的非甲基化區域往往通過高濃度的CpG聚集和組蛋白的修飾避免甲基化〔9〕。

另外，啟動子和內含子中的CpG甲基化已被廣泛研究，近來越來越多的學者對非CpG序列的甲基化感興趣，它包括CA、CT或CC(非CpG)二核苷酸中的胞嘧啶甲基化。但是CpG甲基化可以發生在細胞任何時期的基因沉默，而非CpG的甲基化主要出現在胚胎干細胞和神經生長發育中〔10〕。DNA甲基轉移酶(DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，將甲基基團轉移至胞嘧啶上。DNMT有五種：DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L〔11〕。根據不同DNMT在DNA甲基化中的作用方式不同，可分為持續性甲基化和從頭甲基化兩種模式。DNMT1即參與了持續性甲基化，在DNA復制過程中，DNMT1根據親鏈上特異的甲基化位點，在子鏈相應位置上進行甲基化修飾。DNMT3a和DNMT3b參與DNA甲基化的從頭合成，對未甲基化的DNA中CpG位點進行甲基化。DNMT3L是一種相關蛋白調節因子，本身不具有DNA甲基化功能，但可調節DNMT3a和DNMT3b的活性。DNMT2可催化38-胞嘧啶的天門冬氨酸轉運RNA的反密碼子環，使其甲基化。

除了5mC之外，還存在另一種甲基化胞嘧啶，即5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)。5hmC最早于1972年首次在哺乳動物DNA中被發現，是10-11易位蛋白(TET)家族的酶通過氧化5mC產生的。5hmC也可通過活化誘導脫氨酶/載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽家族(AID/APOBEC)介導分解為5mC〔12〕。2009年，有兩個研究團隊分別同時報道5hmC在小鼠大腦及胚胎干細胞中有著豐富表達，羥甲基化的概念才又一次進入人們的視野并得到重視。5hmC被認為可能也是一個重要的表觀遺傳學標記，可能影響轉錄調控，或在參與去甲基化過程中與基因激活相關〔13〕。因此，DNA甲基化具備對基因表達調控的有效分子途徑，甲基化的相對穩定、易檢測和可逆性，也使其下一步更可能成為表觀遺傳學的分子標記物和治療靶點。

DNA甲基化與組蛋白乙酰化共同作用可調控記憶的形成和突觸的可塑性〔14〕。并且可能對控制行為的基因和神經功能造成影響〔15〕。除此之外，最近幾年已有大量的研究發現DNA甲基化、染色質結構和基因沉默之間的關系，并且認為基因沉默是神經變性疾病(如阿爾茨海默病)的表觀遺傳學發病機制之一〔16〕。因此，我們也推測DNA甲基化與神經變性疾病ALS亦有可能的相關性。

2 DNA甲基化與ALS發病的相關性

ALS是一種侵犯運動系統的原發性、致命性神經變性疾病，臨床顯著特征是同時出現腦干和脊髓的下運動神經元，以及運動皮質的上運動神經元損害體征。這些神經元的丟失會導致以下臨床癥狀：肌萎縮、肌無力、肌束震顫、肌肉痙攣和認知功能障礙〔17〕。目前認為與ALS發病相關的機制包括氧化應激、興奮性氨基酸的毒性作用、軸突運輸的受損、神經生長因子的缺乏、神經炎癥反應、凋亡以及蛋白質轉換的改變等等，并且，還發現星形膠質細胞和小膠質細胞對運動神經元微環境的影響也是ALS發病的原因之一〔18〕。無論遺傳還是環境因素，都不能單一地解釋ALS的發病。所以，與其他神經變性疾病一樣，DNA甲基化可能通過基因和環境的多因素潛在地影響著ALS的發病。

2.1DNA甲基化對ALS遺傳因素的影響

2.1.1ALS發病相關的遺傳機制 ALS分為家族性ALS(FALS)和散發性ALS(SALS)兩大類，FALS多為常染色體顯性遺傳，X染色或隱性遺傳少見。目前已發現一些與ALS發病相關的基因突變，其中，20%FALS發病與超氧化物歧化酶-1(SOD1)突變相關。編碼TAR DNA連接蛋白基因(TARDBP)有超過40種不同的錯義突變與FALS相關〔19〕。少于5%的FALS與RNA連接蛋白肉瘤融合基因(FUS)突變相關。C9orf72基因位點是ALS和額顳葉癡呆(FTD)最常見的基因突變。UBQLN2的突變導致X連鎖的TAR DNA結合蛋白-43(TDP-43)陽性的FTD或ALS。MATR3也被認為與ALS發病相關。SETX基因的突變也在ALS與進行性運動神經病變患者中發現。ALS和FTD還被發現與CHCHD10基因突變相關。其它相關基因還有：GRN、ANG、CHMP2B、PEN1、OPTN、VCP等。與SALS發病相關的基因，有編碼組蛋白乙酰轉移酶(HAT)的復合延伸蛋白基因(ELP3)〔20〕、ALS2和ATXN2〔21〕。

2.1.2DNA甲基化在ALS遺傳因素中的研究進展 首先，在ALS患者的大腦和脊髓中發現存在DNMT3a，它可使DNA甲基化具有可逆性，在體外實驗中也發現DNMT3a的過度表達會促進類似運動神經元的細胞死亡〔22〕。ALS患者的血液和神經組織中也顯示全基因組甲基化和羥甲基化增多〔23〕，并找到ALS患者大腦和脊髓組織中基因甲基化的位點〔24〕。全基因組甲基化測序顯示與ALS發病相關的OPTN基因(編碼視神經蛋白的基因，optineurin)呈現出低甲基化。

其次，與ALS相關的C9orf72基因，發現其中的堿基重復擴增與CpG島的超甲基化相關。在ALS患者的組織樣本中發現，C9orf72基因CpG島超甲基化與重復擴增序列出現呈相關性〔25〕。FTD患者的血液標本檢測，攜帶C9orf72基因擴增的患者相比未攜帶者，甲基化水平明顯升高〔26〕。但C9orf72啟動子的超甲基化被推測可阻止與堿基重復擴增相關的異常損害。在人淋巴細胞系中發現，啟動子的超甲基化導致C9orf72基因的轉錄沉默，但去甲基化卻逆轉了它的保護性作用〔27〕。DNA甲基化的修飾在其他核苷酸重復擴增序列的神經變性疾病中也出現，如脊髓小腦性共濟失調1型、遺傳性共濟失調、X染色體易損綜合征、肌強直性營養不良、帕金森病和阿爾茨海默病〔22，25，28，29〕。這些證據都支持一個論點，即DNA甲基化的修飾可能參與了ALS患者神經元的變性。見表1。

在大鼠模型中，運動神經元凋亡的過程中DNMT1、DNMT3a和5mC的變化與人類ALS的相類似，說明DNMT通過DNA甲基化可能介導了神經元細胞的死亡。另外，人類ATXN2(編碼一種多谷氨酰胺(polyQ)蛋白)基因啟動子的CpG甲基化與脊髓小腦共濟失調2型(SCA2)中CAG異常擴增相關〔30〕。ATXN2基因中這一異常的擴 增被證實會導致ALS發生〔31〕，因此，我們推斷ATXN2啟動子的甲基化可能與ALS的發病存在關聯。

另外，也存在著一些相反結果的研究。SOD1和VEGF(編碼血管內皮生長因子的基因，控制血管生長的信號分子)的表觀遺傳學研究發現，在ALS患者中，這些基因的啟動子區域大部分為未甲基化的，表明通過DNA甲基化而實現的轉錄沉默并不是這一類ALS的常見發病機制〔32〕。見表2。

研究發現人類谷氨酸轉運蛋白EAAT2(在鼠類稱為GLT-1)基因啟動子的甲基化與該基因沉默狀態相關，并且EAAT2轉運蛋白的功能障礙可能導致了ALS的發病〔33〕。因此，在ALS模型中進一步證實，是否通過DNA甲基化表觀遺傳學機制來調節EAAT2轉運蛋白功能的機制是十分有意義的。在大鼠星形膠質細胞中，GLT1啟動子的CpG島特異性超甲基化被證實參與了GLT1啟動子功能的抑制。但在EAAT2基因異常的ALS患者中，這一抑制作用被證實并未導致星形膠質細胞的功能障礙〔34〕。正是因為上述研究結果的互相矛盾，需要收集更權威和更令人信服的證據以證實DNA甲基化通過調控EAAT2的表達而參與了ALS的發病。

表1 可能參與ALS神經元變性的甲基化修飾位點

表2 與ALS發病相關基因的特異性位點甲基化情況

2.2DNA甲基化對環境因素的影響 盡管已發現ALS的發病有明顯的遺傳易感性，但仍有許多發病原因歸于環境因素〔35〕，SALS被發現與以下因素相關，如有毒物質的接觸、飲食、炎性細胞因子、獲得性基因突變等。這些因素很可能都參與到由表觀遺傳學修飾所介導的分子機制中。

暴露于重金屬被證實與SALS相關，對重金屬解毒功能的受損會導致SALS的明顯易感性。金屬硫蛋白是一類對重金屬起主要解毒作用的蛋白家族。事實上，在任何一例SALS患者或對照組中，未發現人類金屬硫蛋白基因啟動子的甲基化，說明這一基因啟動子的甲基化可能并不是SALS的常見病因〔36〕。然而，在一些病例的海馬細胞中發現ALS2基因啟動子的甲基化程度發生改變，其中更高水平的啟動子甲基化被證實與ALS轉錄抑制相關，而他們在兒童時期均有過受虐病史〔37〕。說明DNA甲基化參與了ALS基因的調控過程。

3 結語與展望

上述大量研究闡述了DNA甲基化與ALS的相關性。通過對表觀遺傳學的研究，也對它提出了新的定義理解，認為它是一種染色質結構在適應各種狀態時隨之改變的機制〔38〕。

它參與整合神經元的發生發展、可塑性以及老化過程，可應對除遺傳因素之外的其它刺激，使細胞維持穩態〔6〕。但作為一個新興領域，表觀遺傳學、DNA甲基化還有許多未完全明確的問題。DNA甲基化作為ALS發病的原因之一也提示了我們一種新的治療途徑。同時，因為在大腦不同區域里的不同細胞中DNA甲基化模式不同〔39〕，所以要明確DNA甲基化在ALS發病中確切機制，還需要更大樣本量更多時間觀察點的進一步研究。

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〔2016-11-13修回〕

(編輯 袁左鳴)

江西省自然科學青年基金項目(20161BAB215233)

徐仁伵(1969-)，男，博士生導師，主要從事神經變性疾病研究。

吳成斯(1984-)，女，講師，主要從事神經變性疾病研究。

R746.4

A

1005-9202(2017)16-4147-05；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.107