Uba-2在肝癌組織中的表達及其對肝癌細胞增殖和侵襲轉移能力的影響

袁 征，李 珍，孫彥珍

Uba-2在肝癌組織中的表達及其對肝癌細胞增殖和侵襲轉移能力的影響

袁 征，李 珍，孫彥珍

目的 探討Uba-2在肝癌組織中的差異表達以及過表達和低表達時其對肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響。方法 qRT-PCR法檢測肝癌組織中Uba-2 mRNA的表達；將Uba-2的過表達載體和siRNA表達載體轉染至肝癌細胞HepG2后，MTS實驗檢測Uba-2對肝癌細胞增殖能力的影響；細胞遷移/侵襲實驗檢測其對肝癌細胞侵襲轉移能力的影響；Western blot法檢測肝癌細胞HepG2中TGF-β1～3及VEGF、Snail蛋白的表達。結果 Uba-2在肝癌組織中呈高表達，與癌旁肝組織中的表達差異有顯著性(P<0.01)，qRT-PCR法檢測Uba-2在HepG2細胞中過表達或低表達；細胞增殖實驗數據顯示Uba-2表達水平與肝癌細胞HepG2的增殖能力相關，siRNA干擾沉默HepG2細胞中Uba-2的表達會抑制其增殖生長，細胞遷移/侵襲實驗數據顯示Uba-2過表達能促進肝癌細胞HepG2的侵襲、轉移能力，且與陰性對照組細胞相比差異有統計學意義；Western blot結果顯示Uba-2的異常表達影響TGF-β2及VEGF、Snail蛋白表達水平。結論 Uba-2基因在肝癌組織中的高表達可能具有促進肝癌細胞增殖及侵襲轉移的作用。

肝腫瘤；細胞增殖；侵襲轉移；Uba-2

肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一，由于肝炎病毒感染漸為普遍，原發性肝癌的發病率也逐年增加，且原發性肝癌無特異性臨床表現，確診時多為中晚期[1]。類泛素化修飾(small ubiquitin-like modifier, SUMO)是一種重要的蛋白翻譯后修飾形式，可調節靶蛋白的活性與功能。SUMO在轉錄、DNA修復、核質物質轉運及染色體分離等方面發揮重要作用[1-2]，其中SUMO-1是SUMO家族成員之一，SUMO-1可抑制p53基因的活性[3-4]，促使癌癥的發生、發展和轉移，而SUMO的激活需SUMO活化酶E1催化，E1是由Aos-1和Uba-2組成的異二聚體[5]。研究[6]發現Uba-2在甲狀腺嗜酸細胞腫瘤和人類前列腺癌等癌癥組織中出現異常表達，Uba-2基因的沉默會在一定程度上影響腫瘤細胞的增殖以及侵襲轉移等過程。本課題組初步研究發現，Uba-2在肝癌組織中的表達顯著高于非肝癌組織，而Aos-1的表達無明顯差異。為進一步探討Uba-2與肝癌細胞增殖和侵襲的關系，本實驗通過檢測Uba-2的過表達或低表達對肝癌細胞株中細胞增殖以及侵襲能力的影響，探討其在肝癌發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 40例標本來源于原發性肝癌患者，患者均簽署知情同意書且均未接受其他治療，包括30例男性和10例女性的肝癌組織及癌旁肝組織。肝癌細胞株HepG2購于中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)。

1.2 儀器及試劑 脂質體Lipofectamine 2000、TRIzol(Invitrogen公司，USA)；PrimeScripts RT Reagent Kit(Takara公司，China)；Transwell Flters (8 μm；Millipore, USA)；RPMI 1640、Opti-MEMI培養液和胎牛血清(Gibco公司，USA)。定量PCR采用SYBR Green PCR Master Mix(日本TOYOBO公司)；ABIPRISM 7500定量PCR儀；抗體為英國Abcam公司產品。Uba-2過表達載體和siRNA干擾表達載體以及Uba-2引物由廣州銳博公司設計與合成。

1.3 細胞轉染 Lipofectamine 2000轉染試劑盒轉染。實驗分為陰性對照組(只有脂質體)、Uba-2過表達組(Uba-2過表達載體和脂質體)和Uba-2干擾表達組(加入Uba-2 siRNA干擾表達載體100 nmol/L和脂質體)。轉染成功后于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養基中48 h，收集細胞進行各項檢測。

1.4 Uba-2在肝癌組織及細胞株中的表達 采用Trizol試劑提取肝癌組織中和各組細胞中的總RNA；采用PrimeScripts RT Reagent Kit試劑盒反轉錄合成cDNA；采用qRT-PCR技術檢測Uba-2在組織和細胞株中的表達水平。每一樣品重復3次，以U6作為內參，記錄Ct值。定量PCR反應程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min預變性(1個循環)；95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，40個循環。各組間Uba-2相對定量的倍數用2-△△Ct值表示。

1.5 Uba-2過表達或低表達對肝癌細胞增殖能力的影響 收集各個時間點的細胞進行檢測：在0.2 mL臺盼藍(含0.1%Trypan Blue的PBS)中加0.2 mL細胞懸液，沒有活性的細胞被染成藍色；立即用微量巴氏吸管混勻后，吸足量細胞懸液從血細胞計數室的兩邊加樣；使用Freshney計數板計算細胞數。

1.6 細胞劃痕法檢測肝癌細胞株遷徙能力 將轉染后的HepG2細胞株分別培養于6孔板中直到板孔被細胞覆蓋，用200 μL移液器槍頭刮一個直徑約200 μm的垂直劃痕，PBS緩沖液沖洗3次，37 ℃孵育。24 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞平均遷徙距離，遷徙距離=總面積/高度，每組實驗平行3次。

1.7 Transwell法檢測肝癌細胞株侵襲能力 按照Milipore公司Transwell小室說明書操作，于100 μL基質膠中以1 ∶8稀釋的無血清培養基中過夜孵育。常規培養12～16 h，3.7%甲醛固定細胞2 h，1%結晶紫染色，隨機選5個視野計數，倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.8 Western blot法檢測TGF-β1～3及VEGF、Snail蛋白的表達 轉染48 h后收集各組細胞，制備細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量檢測后按一定濃度進行SDS-PAGE恒壓電泳。以GAPDH為內參，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體為二抗，檢測TGF-β1～3及VEGF、Snail蛋白的表達。

2 結果

2.1 Uba-2在肝癌組織以及肝癌細胞株中的表達 Uba-2在肝癌組織中高表達，與癌旁肝組織中的表達相比差異有顯著性(P<0.01，圖1)；肝癌細胞株轉染Uba-2過表達和干擾表達載體48 h后，qRT-PCR檢測出Uba-2過表達組在HepG2細胞株中呈高表達，Uba-2干擾表達組在細胞株中呈低表達，與陰性對照組相比差異均有顯著性(P<0.01，圖2)。

圖1 Uba-2在肝癌和癌旁肝組織中的表達

圖2 Uba-2在肝癌細胞株HepG2中的表達

2.2 過表達或低表達Uba-2對肝癌細胞增殖能力的影響 由HepG2細胞生長曲線可見，轉染72 h后，Uba-2過表達組細胞的生長受到明顯促進，而Uba-2干擾表達組受到明顯的抑制，在96 h兩組的作用效果最為明顯(圖3)。說明Uba-2的表達水平與肝癌細胞HepG2的增殖能力相關，siRNA干擾沉默HepG2細胞中Uba-2的表達會抑制其增殖生長。

2.3 過表達或低表達Uba-2對肝癌細胞侵襲、轉移能力的影響 遷移實驗結果顯示，Uba-2過表達組較陰性對照組細胞二維水平遷移速度明顯提高(P<0.05)，而Uba-2干擾表達組較陰性對照組細胞二維水平遷移速度明顯降低(P<0.05)。侵襲實驗中陰性對照組視野平均侵襲細胞數為61.9±14.5，Uba-2過表達組的平均侵襲細胞數為99.2±10.2；較陰性對照組侵襲力上調，差異有顯著性(P<0.01)，Uba-2干擾表達組視野平均侵襲細胞數為36.5±6.7，較陰性對照組侵襲力下調，差異有顯著性(P<0.05，表1，圖4)。

圖3 Uba-2對HepG2細胞增殖能力的影響

表1 Transwell法檢測肝癌細胞株侵襲能力

與陰性對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.4 Western blot法檢測肝癌細胞株TGF-β1～3及VEGF、Snail蛋白的表達 Western blot法檢測HepG2細胞株中TGF-β1～3及VEGF、Snail蛋白的表達，結果顯示，相對于陰性對照組，Uba-2過表達組中TGF-β2的表達上調且VEGF、Snail蛋白的表達量也有所增加，TGF-β1和TGF-β3的表達量無明顯變化；而Uba-2干擾表達組中TGF-β2、VEGF和Snail的表達均下調。表明Uba-2的異常表達會影響TGF-β2及VEGF、Snail蛋白的表達(圖5)。

圖5 Western blot法檢測TGF-β1～3及VEGF、Snail蛋白的表達

1.陰性對照組；2.Uba-2干擾表達組；3.Uba-2過表達組；a.Uba-2過表達組；b.陰性對照組；c.Uba-2干擾表達組

3 討論

腫瘤的發生、進展是多因素參與的復雜過程，環境、遺傳、基因等均與之發生有著密切的關系[7]。如促癌基因的激活、抑癌基因功能被抑制或缺失等均有可能導致腫瘤的發生[8]。肝癌在全球各種致死腫瘤中位居第3位，原發性肝癌是最常見的惡性肝腫瘤之一，具有無特異性臨床表現、病情發展迅速和易發生血道轉移、手術后易復發等特點，患者確診時多為中晚期[9]。SUMO通過參與功能蛋白翻譯后的修飾，在轉錄、DNA修復、核質物質轉運及染色體分離等方面發揮重要作用[10-12]；SUMO靶蛋白不是引導靶蛋白降解，而是通過和靶蛋白共價結合后調節靶蛋白的功能，修飾的底物蛋白非常廣泛，參與多種蛋白翻譯后功能的調節。在蛋白酶的水解作用下Uba-2過表達組細胞遷移速度高于陰性對照組、Uba-2干擾表達組；Uba-2過表達組的平均侵襲細胞數高于陰性對照組和Uba-2干擾表達組前體蛋白形成成熟的SUMO分子，現已發現能與SUMO結合并被其修飾的蛋白百余種，其大部分是核蛋白，包括p53、MDM2等與轉錄及調控細胞周期密切相關的蛋白合[13]；部分為胞質表達，如低氧耐受因子(HIF-1α)，很多癌基因和抑癌基因功能均受SUMO的調節，包括p53、雙微基因2(MDm2)、PML等[14]，這些基因的活性、表達水平及定位的變化對腫瘤發展至關重要。同時，SUMO分子在活化酶E1作用下激活，SUMO活化酶E1則是由Aos-1和Uba-2兩個亞基組成的異源二聚體，且SUMO的激活需Uba-2提供SUMO活性位點的半胱氨酸殘基并形成巰酯鍵，然后再被轉移與靶蛋白結合[8]，SUMO才可被激活。由此可見，Uba-2表達在SUMO中具有重要意義，雖已知泛素活化酶E1在泛素化信號通路中的作用機制及其重要性，了解SUMO和腫瘤關系密切,可促進癌癥的發生、發展和轉移[15]，但現有針對泛素活化酶E1主要構成物質Uba-2參與腫瘤發生、發展的研究相對較少，Uba-2在肝癌中的表達機制及對肝癌細胞株中細胞增殖以及侵襲能力方面的影響尚未完成闡明，鑒于此，本組實驗檢測了肝癌中Uba-2表達，旨在進一步探討Uba-2在肝癌發生、發展中的作用。

圖4 劃痕實驗結果

本實驗檢測肝癌及癌旁組織中Uba-2 mRNA的表達，利用Uba-2的過表達載體和siRNA表達載體轉染至肝癌細胞HepG2，通過MTS實驗和細胞遷移/侵襲實驗觀察Uba-2在肝癌組織中的差異表達以及過表達和低表達時其對肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響。Uba-2在肝癌組織中呈高表達，較癌旁肝組織中的表達差異有顯著性；細胞增殖實驗數據顯示Uba-2的表達水平與肝癌細胞HepG2的增殖能力相關，siRNA干擾沉默HepG2細胞中Uba-2的表達會抑制其增殖生長；細胞遷移/侵襲實驗數據顯示Uba-2的過表達能促進肝癌細胞HepG2的侵襲轉移能力，且與陰性對照組細胞相比差異有統計學意義；Western blot檢測結果顯示Uba-2影響與增殖侵襲有關的信號分子TGF-β2、VEGF和Snail的表達水平。推測肝癌細胞中Uba-2主要針對某些與肝癌細胞增殖侵襲相關靶蛋白的SUMO，影響腫瘤細胞增殖與侵襲過程有關的信號通路如TGF-β2、VEGF等[16]，進而影響肝癌細胞的增殖和侵襲能力，因此Uba-2在肝癌組織中的高表達可能具有促進肝癌增殖侵襲的作用。在后續實驗中將探討Uba-2激活SUMO在肝癌細胞中對哪些靶蛋白起作用，為肝癌尤其原發性肝癌發生機制的研究以及為肝癌的臨床診斷和生物治療提供有效靶點。

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Expression of Uba-2 in hepatic carcinoma andits effect on the proliferation, invasion and metastasis of hepatoma cells

YUAN Zheng, LI Zhen, SUN Yan-zhen

(DepartmentofPathology,CentralHospitalofNanyang,Nanyang473000,China)

Purpose To investigate the effect of differential expression, over expression and low expression of Uba-2 in hepatic carcinoma on the proliferation and invasion of hepatoma cells. Methods The expression of Uba-2 mRNA in clinical specimens was detected by qRT-PCR. After transfection of Uba-2 over expression vector and siRNA expression vector into hepatoma cell HepG2, the effect of Uba-2 on proliferation of hepatoma cells was detected by MTS assay while the effect on the invasion and metastasis of hepatoma cells was detected by cell migration/invasion assay. The expression levels of TGF-β1-3, VEGF and Snail proteins in hepatoma cell HepG2 were detected by Western blot. Results The expression of Uba-2 was high in hepatic carcinoma. Compared with that in adjacent liver tissues, there were significant differences (P<0.01). qRT-PCR detected over expression or low expression of Uba-2 in HepG2 cells. Cell proliferation data showed that the expression level of Uba-2 was related to the proliferation ability of hepatoma cell HepG2, and siRNA interferring the expression of Uba-2 in silent HepG2 cells could inhibit its growth. The data of cell migration/invasion showed that over expression of Uba-2 could promote the invasion and metastasis of hepatoma cell HepG2. Compared with cells in the control group, there were statistically significant differences. The results of Western blot indicated that the abnormal expression of Uba-2 affected the expression levels of TGF-β2, VEGF and Snail proteins. Conclusion The high expression of Uba-2 gene in hepatic carcinoma may promote the proliferation, invasion and metastasis of hepatoma cells.

hepatic neoplasms; cell proliferation; invasion and metastasis; Uba-2

河南省南陽市中心醫院病理科，南陽 473000

袁 征，女，碩士，主治醫師。E-mail: yzyz2128@163.com 李 珍，女，副主任醫師，通訊作者。E-mail: zhengIi6366@163.com

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.003.html

R 735.7

A

1001-7399(2017)08-0837-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.003

接受日期：2017-06-19