云南地區非小細胞肺癌患者外周血EGFR基因突變與臨床病理特征的關系

楊長紹，杜亞茜，丁曉潔，楊延龍，李 權，郭銀金，劉俊熙，周永春

云南地區非小細胞肺癌患者外周血EGFR基因突變與臨床病理特征的關系

楊長紹，杜亞茜，丁曉潔，楊延龍，李 權，郭銀金，劉俊熙，周永春

目的 探討云南地區非小細胞肺癌外周血中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變及與臨床病理特征的關系，為該地區的肺癌個體化靶向治療奠定基礎。方法 應用突變擴增阻滯系統(amplification refractory mutation system, ARMS)檢測非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)外周血中EGFR基因第18、19、20及2l外顯子突變情況，統計分析各類突變與患者臨床病理特征的相關性。結果 在364例患者中，EGFR基因突變者93例(25.5%)。其中EGFR 18 G719X突變占3.2%(3/93)，EGFR 19缺失突變占48.4%(45/93)，EGFR 20 S768I、T790M、20ins突變分別占3.2%(3/93)、2.2%(2/93)、3.2%(3/93)，EGFR 21 L858R、L861Q突變分別占26.9%(25/93)、1.1%(1/93)；雙突變比例占11.8%，其中3例樣本3.2%(3/93)存在G719X、S768I雙突變，4例樣本4.3%(4/93)存在19Del、T790M雙突變，1例樣本1.1%(1/93)存在19Del、L858R雙突變，1例樣本1.1%(1/93)存在L858R、S768I雙突變，2例樣本2.2%(2/93)存在S768I、T790M雙突變。EGFR基因突變與患者性別、臨床分期、組織學類型相關(P<0.005)，而與患者年齡、是否吸煙無明顯相關(P>0.05)。結論 云南地區ⅢB～Ⅳ期NSCLC患者外周血中，女性腺癌突變率較高，且該地區NSCLC患者外周血EGFR基因突變存在外顯子19缺失突變為主及雙突變率較高的特征。使用ARMS技術檢測NSCLC患者外周血EGFR基因突變可為臨床使用EGFR-TKIs提供準確的指導。

肺腫瘤；非小細胞肺癌；表皮生長因子受體；外周血；突變擴增阻滯系統

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，全球每年因肺癌死亡的人數超過100萬，其中非小細胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)最常見，占全部肺癌的80%～90%[1]。我國肺癌病死率較高，而云南的肺癌發病率與病死率位居國內榜首，存在區域性點狀高發、女性高發的特征。分子靶向治療被認為是治療晚期NSCLC的主要方法，其中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變狀態是決定EGFR-TKIs療效最重要的預測指標，檢測EGFR基因突變狀態是決定患者是否能夠應用EGFR-TKIs治療的先決條件[2]。目前腫瘤組織樣本仍是獲取腫瘤基因相關信息的主要來源，然而大部分患者就診時已是晚期，組織標本獲得比較困難、組織異質性及無法動態監測等諸多因素限制了有效的EGFR基因突變檢測，為臨床醫師是否選擇使用TKIs治療帶來困難。相關研究報道[3]，實體腫瘤患者的外周血中存在來源于凋亡、壞死腫瘤細胞的游離DNA。多項回顧性和前瞻性研究也表明，當腫瘤組織難以獲取時，血液循環游離或腫瘤DNA(cf/ctDNA)檢測是突變分析合適的替代品[4-5]。《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》明確指出：無法獲取足夠腫瘤組織及細胞學標本的晚期肺腺癌患者，可用血液標本進行EGFR基因突變檢測。本實驗應用突變擴增阻滯系統(amplification refractory mutation system, ARMS)檢測NSCLC患者外周血EGFR突變狀態，探討云南地區NSCLC患者外周血EGFR基因突變的流行狀況，同時與患者臨床病理特征進行相關性分析，為不能進行組織EGFR突變檢測的患者使用分子靶向治療提供證據。

1 材料與方法

1.1 材料 選取云南省腫瘤醫院2015年11月～2016年9月期間存檔的NSCLC Ⅱb～Ⅳ期患者外周血液標本364例。364例NSCLC患者中，男性217例(59.6%)，女性147例(40.4%)；中位年齡60歲(26～86歲)，其中≥60歲者185例(50.8%)，<60歲者179例(49.2%)；病理分型：腺癌254例(69.8%)，非腺癌110例(30.2%)；臨床分期：ⅡB～ⅢA期76例(20.9%)，ⅢB～Ⅳ期288例(79.1%)；曾經或正在吸煙者165例(45.3%)，從未有過吸煙史者199例(54.7%)。

熒光定量PCR儀(Stratagene Mx3000P)購自安捷倫科技公司，微量紫外分光光度計(Nano Drop 2000)購自美國Thermo公司，核酸提取試劑Circulating DNA Kit(Spin Column)及人類EGFR基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)均購于廈門艾德生物公司。

1.2 樣本處理及DNA提取 用含EDTA抗凝劑采血管，抽吸體積為10 mL外周血，立即將采集好血樣的采血管輕柔地上下顛倒混勻；然后2 000g4 ℃離心10 min，取上清，將獲得的上清再8 000g4 ℃離心10 min，取上清，此上清即為血漿。按Circulating DNA Kit(Spin Column)說明書提取DNA，所提取的DNA保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 ARMS 根據試劑盒說明書檢測EGFR基因突變。分別取42.3 μL樣品DNA、陽性及陰性質控品，加入2.7 μL Taq酶，混勻后加入八聯PCR管中，每管5 μL。每次反應均設置陽性及陰性對照。PCR反應參數：第一階段：95 ℃ 5 min，1個循環；第二階段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個循環；第三階段：93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個循環；并在第三階段60 ℃時收集FAM和HEX(或VIC)信號。突變結果根據說明書判讀原則進行判讀。

1.4 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析EGFR基因突變與臨床分期、患者性別、年齡、組織學類型、有無吸煙等臨床病理特征的相關性，χ2檢驗檢測結果是否具有統計學意義，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR基因突變頻率與類型 364例患者中，EGFR基因突變患者93例(25.5%)。其中EGFR 18 G719X突變占3.2%(3/93)，EGFR 19缺失突變占48.4%(45/93)，EGFR 20 S768I、T790M、20ins突變分別占3.2%(3/93)、2.2%(2/93)、3.2%(3/93)，EGFR 21 L858R、L861Q突變分別占26.9%(25/93)、1.1%(1/93)；且有3例標本(3.2%，3/93)存在G719X、S768I雙突變，4例標本(4.3%，4/93)存在19Del、T790M雙突變，1例標本(1.1%，1/93)存在19Del、L858R雙突變，1例標本(1.1%，1/93)存在L858R、S768I雙突變，2例標本(2.2%，2/93)存在S768I、T790M雙突變(圖1)。

圖1 云南地區非小細胞肺癌患者 外周血EGFR基因突變分布

2.2 EGFR基因突變與患者臨床病理特征的相關性 147例女性患者中，52例(35.3%)有EGFR基因突變，明顯高于男性患者(18.9%)(P<0.001，表1)。ⅢB～Ⅳ期NSCLC患者88例(30.6%)有EGFR基因突變，顯著高于ⅡB～ⅢA期患者(6.6%，P<0.001)。腺癌患者EGFR基因突變率高于非腺癌患者(33.5%vs7.3%)，差異有顯著性(P<0.001)，而與年齡、是否吸煙無明顯相關(P>0.05，表1)。

表1 云南地區外周血EGFR突變與臨床病理特征的相關性[n(%)]

3 討論

EGFR基因位于人第7號染色體p13-q22區域，全長約20萬個堿基，共有28個外顯子，分別編碼胞外區、跨膜區以及胞內區三個部分，共1 186個氨基酸，其糖基化蛋白的相對分子質量為17.0×104，胞內區具有絡氨酸激酶活性，負責將胞外信號傳遞到胞內。EGFR可通過與配體結合后自動激活其同源或異源二聚體以及酪氨酸酶的自身磷酸化，從而導致其下游：Ras→Raf→MAPK和PI3K→PKC→IKK途徑的激活。這些信號途徑的激活可導致細胞增殖、生存、侵襲和轉移以及新生血管的形成，是許多惡性腫瘤的發病機制、進展惡化、預后差的原因。大量研究表明[6-7]，EGFR基因第18、19、21外顯子發生突變的NSCLC患者服用EGFR-TKIs類藥物的療效較好，而EGFR野生型患者則無法從中獲益。因此，檢測肺癌患者EGFR基因突變狀態，對是否應用EGFR-TKI藥物及療效預測意義重大。腫瘤組織樣本(手術、活檢、細胞蠟塊)是檢測晚期NSCLC EGFR突變狀態最適合的樣本來源。然而并非所有患者都能提供足夠的組織樣本，可通過經支氣管鏡、肺穿刺活檢或胸腔積液標本來進行突變檢測，但仍不能覆蓋所有晚期患者。目前已有大量的研究證實[5,8]，外周血游離DNA中EGFR基因突變狀態與腫瘤組織中的EGFR基因突變狀態具有高度的相關性。且2014年9月歐洲藥品管理局已批準可采用ctDNA標本來評估EGFR突變狀態；中國國家食品藥品監督管理局在2015年2月也已批準Gefitinib說明書更新，在推薦所有NSCLC患者的腫瘤組織都應進行EGFR突變檢測基礎上，補充了如果腫瘤標本不可評估，則可使用從血液(血漿)標本中獲得的ctDNA。 ctDNA是指人體血液循環系統中不斷流動的攜帶一定特征(包括突變、缺失、插入、重排、拷貝數異常、甲基化等)來自腫瘤基因組的DNA片段。ctDNA的主要來源包括壞死的腫瘤細胞、凋亡的腫瘤細胞、循環腫瘤細胞及腫瘤細胞分泌的外排體。

云南地區肺癌發病率與病死率一直位居國內榜首，與全球及我國其他省份的肺癌高發不同，云南的肺癌表現為區域性點狀高發，主要集中在個舊和宣威兩個地區[9]。分析其原因，除煙草暴露外，室內污染、職業性暴露與肺癌發病有重要的關系。調查發現，宣威地區肺癌的高發與工業污染無明顯關系，但生活燃料、室內燃煤空氣污染卻與肺癌的發病密切相關；個舊地區錫礦工人中肺癌發病率異常主要與職業性暴露因素相關，如氡子體、砷和粉塵等。本組實驗的目的是通過檢測外周血游離DNA中EGFR基因突變狀態，探討云南地區NSCLC患者外周血EGFR突變與患者臨床病理特征的相關性分析，為不能進行組織EGFR突變檢測的患者使用分子靶向治療提供證據。

目前血液EGFR基因突變檢測方法主要有ARMS技術、二代測序技術(next generation sequencing, NGS)、數字PCR等[5,10-11]。NGS技術擴展了基因突變檢測的深度和廣度[10]，但其臨床轉化應用更需要大量數據積累。數字PCR在血漿EGFR突變檢測上具有較高的靈敏度和特異度[11]，但目前報道的該方法檢測EGFR突變位點相對有限，仍處在摸索、累積經驗階段，其對操作人員和環境均有較高的要求，未來應用于臨床尚需大規模臨床數據驗證。目前成熟且常用檢測血液EGFR基因突變的方法是ARMS技術，該技術檢測血漿相比于腫瘤組織其EGFR敏感型突變的靈敏度在65%～88%，特異度在90%～100%，且已被歐盟批準用于指導EGFR-TKIs治療的血液檢測方法[5,8]。

本組實驗中ⅡB～ⅢA期NSCLC EGFR基因突變發生率為6.6%(5/76)，ⅢB～Ⅳ期為30.6%(88/288)，兩者之間差異有統計學意義(P<0.001)。多項研究表明[6,12]，在女性、腺癌和非吸煙者中EGFR基因的突變率較高。本組實驗亦發現在腺癌患者中EGFR的突變率(33.5%vs7.3%)明顯高于非腺癌患者，兩組之間差異有統計學意義(P<0.001)；女性患者EGFR基因突變占40.4%(147/364)，突變率(35.3%vs18.9%，P<0.001)顯著高于男性患者，與之前的研究報道相符。但吸煙患者EGFR基因突變率(21.8%)與不吸煙患者突變率(28.6%)相比，兩組差異無統計學意義(P>0.05)。與相關文獻報道[12]不吸煙的NSCLC患者EGFR突變率高于既往吸煙者存在差異，可能是云南部分地區主要以煙煤為主要生活燃料，煙煤燃燒后排放出含有大量以苯并(A)芘為代表的致癌性多環芳烴類物質(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)的特殊煤煙污染環境有關。

在中國EGFR基因的突變存在顯著的地域差異，據文獻報道[13-14]，臺灣地區的EGFR基因的突變以外顯子21為主，云南和廣東地區以外顯子19為主；本組結果顯示，云南地區NSCLC患者外周血中，EGFR基因的突變主要發生在19號外顯子，與報道一致。EGFR基因敏感性突變中最常見、與臨床療效最為相關的突變包括19外顯子缺失突變及21外顯子L858R突變，這兩類經典突變占所有EGFR突變的62%～83%[15]；本組364例患者外周血中EGFR基因19外顯子缺失突變及21外顯子L858R突變占總突變的76.3%(71/93)，與之前的研究報道相符。目前20外顯子的T790M突變的作用也比較明確，即與EGFR-TKIs原發及繼發耐藥相關。本組中T790M突變占2.2%(2/93)，均為原發耐藥；另有6例標本(6.5%，6/93)存在繼發耐藥突變，其中4例標本(4.3%，4/93)存在19Del、T790M雙突變，2例標本(2.2%，2/93)存在S768I、T790M雙突變。少見突變即除外19缺失突變、L858R、T790M突變以外的所有突變，如E709、G719、S768、L861等位點的氨基酸替換突變[16]。本組少見突變位點中最常發生的突變位點為G719X及S768I。G719X位于EGFR基因18外顯子第719位的甘氨酸(Glysine，G719)，正好坐落在ATP結合活化位點附近的磷酸化結合環(phosphate-binding loop, P-loop)上，該位點氨基酸的核苷酸密碼子為GGC，當該核苷酸密碼子發生點突變時，甘氨酸可突變為丙氨酸(Alanine, G719A)、絲氨酸(Serine, G719S)和半胱氨酸(Cysteine, G719C)；本組中G719X(X代表A、C或S)突變約占總突變的6.5%(6/93)，合并其他突變者3例，G719X發生雙突變的概率為50%。S768I突變是發生在EGFR基因20外顯子768號密碼子的點突變(G>T)；本組實驗發現S768I單突變3例，合并其他突變者6例，S768I發生雙突變的概率為66.7%，這與Chen等[17]報道在EGFR基因G719、S768、T790、L861等區域更易合并雙突變的結果部分一致。L861Q突變是由2828位點的T被A取代所致，本組有1例標本1.1%(1/93)存在L861Q突變，與報道[18]EGFR-L861Q僅占EGFR突變陽性的1.12%一致。

在云南地區NSCLC中外周血EGFR基因的突變以外顯子19的缺失突變為主，突變率以腺癌和女性較高。且該地區EGFR少見突變及雙突變相對其它地區較高，EGFR少見突變作為特殊類型的EGFR突變，不同亞型對EGFR-TKIs的敏感性不盡相同。因此，檢測EGFR非常重要，但對于部分患者，特別是ⅢB～Ⅳ期患者很難取到組織標本，為臨床醫師是否選擇使用TKIs治療帶來困難。血液ctDNA EGFR檢測具有無創、便捷、實時可獲取的特點，能在一定程度上幫助解決組織樣本量不足、異質性及反復動態活檢的問題，可作為組織檢測的補充。但目前血液ctDNA EGFR檢測尚存在臨床應用范圍、適用人群、檢測方法等方面標準的不統一，如何有效合理的應用血液EGFR檢測已成為臨床上亟待解決的問題。

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Relationship between EGFR gene mutation and clinicopathologicalfeatures in peripheral blood of patients with non-small celllung cancer in Yunnan area

YANG Chang-shao, DU Ya-xi, DING Xiao-jie, YANG Yan-long, LI Quan, GUO Yin-jin, LIU Jun-xi, ZHOU Yong-chun

(TumorResearchInstitute,theTumorHospitalofYunnanProvince,KeyLaboratoryofLungCancerResearchofYunnanProvince,Kunming650106,China)

Purpose To investigate the prevalence of EGFR mutation in circulating cell-free DNA in non-small cell lung cancer (NSCLC) patients of Yunnan province and its relationship with clinical pathological characteristics, which can provide foundations for individualized targeted therapy of lung cancer in this area. Methods Amplification refractory mutation system (ARMS) was used to detect the EGFR exon 18, 19, 20 and 21 mutation in circulating cell-free DNA. The relationship between EGFR mutation and clinical characteristics were further analyzed. Results 93 patients (25.5%) harbored circulating EGFR mutations among 364 patients. The mutation rates of EGFR 18 G719X, 19del, 20 S768I, T790M, 20ins were 3.2% (3/93), 2.2% (2/93) and 3.2% (3/93) respectively. EGFR 21 L858R and L861Q mutation rates were 26.9% (25/93) and 1.1% (1/93), respectively. Three patients (3.2%, 3/93) harbored G719X+S768I double mutation, four patients (4.3%, 4/93) harbored 19Del+T790M mutations. 19Del+L858R, L858R+S768I, and S768I+T790M mutation rates were 1.1%(1/93), 1.1%(1/93)and 2.2%(2/93)respectively. Conclusion The EGFR mutation rate of female and adenocarcinoma patients is higher in patients with stage ⅢB-Ⅳ NSCLC in Yunnan area. 19Del is the major mutation type and double exon mutation is an obvious characteristic in NSCLC patients of Yunnan province. EGFR mutation detection in circulating cell-free DNA by ARMS method is feasible to screen patients receiving EGFR-TKIs treatment.

lung neoplasms; non-small cell lung cancer; epidermal growth factor receptor; peripheral blood; amplification refractory mutation system

國家自然科學基金(81460441)、云南省應用基礎研究面上項目(2016FB145)、云南省衛生科技計劃項目(2014NS001)

云南省腫瘤醫院腫瘤研究所/云南省肺癌研究重點實驗室，昆明 650106

楊長紹，男，技師。Tel: (0871)68179504，E-mail: yangchangshao@126.com 周永春，女，博士，副主任醫師，碩士生導師，通訊作者。Tel: (0871)68179505，E-mail: chungui7625@163.com

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.010.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)08-0874-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.010

接受日期：2017-04-27