高效液相色譜-串聯質譜法測定人血液中20種毒品的殘留量

孫博

廣東華生司法鑒定中心

高效液相色譜-串聯質譜法測定人血液中20種毒品的殘留量

孫博

廣東華生司法鑒定中心

目的：試建立高效液相色譜-串聯質譜法測定人血液中20種毒品的殘留量方法。方法：配制20種毒品的標準儲備液，并建立標準曲線。進行血液樣本預處理，蛋白用乙腈沉淀離心分離，進行高效液相色譜-串聯質譜法測定。結果：建立了20種毒品的Y（色譜峰面積）與x（濃度）的標準曲線，相關系數均大于0.970，線性范圍1～100μg/kg，回收率、回收率RSD均符合要求。同時1次性檢出樣本中的20種毒品殘留，無雜峰，無嚴重干擾。結論：高效液相色譜-串聯質譜法可同時測定人血液中多種毒品殘留。

毒品；血液檢驗；殘留量；高效液相色譜-串聯質譜法

毒品泛濫已成為威脅人類健康以及社會穩定的重要因素之一[1]。近年來，隨著化學合成技術的進步，毒品的種類明顯增加，純度提高，給毒品人體殘留檢測增加了許多困難。隨著毒品的泛濫，全世界都加強了口岸吸毒人群的監測，部分地區開始對入境人員進行體內毒品的檢測。高效液相色譜-串聯質譜法（High perfor?mance liquid chromatography-Mass spectrometry,HPLC-MS/MS），是當前最先進的物質成分檢測技術之一，結合了色譜以及質譜法兩種技術的優勢，可同時檢測多種物質成分，相較于GC-MS/MS測定方法，樣品處理無需衍生，操作相對簡單，靈敏度高，國內陸續開展了針對一種或數種毒品HPLC-MS/MS檢測體系，檢出限、線性范圍良好。本次研究嘗試構建針對20種毒品殘留量高效液相色譜-串聯質譜法測定體系。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1260高效液相色譜串聯AB QTRAP 3000四級桿質譜聯用儀，IKA MS3渦旋混合器，METTLER TOLEDO電子天平，Milli-Q Reference超純水純化系統，氮吹儀，數控超聲波清洗器，低溫高速離心機，立式透明冷藏箱等。20種毒品標準品，包括苯丙胺、甲基苯丙胺、苯佐卡因，3,4-亞甲基二氧基苯丙胺，咖啡因，氯胺酮，杜冷丁，丁卡因，安定，嗎啡，去甲羥基安定，舒樂安定，可待因，利眠寧，咪達唑侖，美沙酮，蒂巴因，四氫大麻酚，三唑侖，氯氮平，由中國國家標準物質中心提供。此外，還包括甲醇、三氯甲烷、環己烷、乙酸乙酯、純水等標準品。待測樣本取自懷疑吸毒人員，10份，采集自肘部外周靜脈血。

1.2 方法

1.2.1 標準物質工作液

分別稱取以上涉及的20種標準品10.0mg，置于10mL容量瓶中，加入少量甲醇溶解，定容，配制1.0mg/mL溶液，避光保存。稱取一定量的毒品標準物質儲備液，用甲醇稀釋為0.1mg/mL、10μg/ mL、1μg/mL工作液溶液，避光4℃保存。取以上20種毒品標準物質儲備液，甲醇稀釋，配制濃度分別為0.1μg/mL、0.01μg/mL、1μg/ L溶液，避光4℃保存，制備混合標準物質工作液。

1.2.2 血液處理

空白樣品取自無吸毒史的健康人群，抗凝管采集，冷藏保存。取血液1.0mL，置于10mL具塞離心管中，加入5μL 0.2μg/mL的SKF525A內標工作液，加入有機10mL試劑，超聲下液液萃取，渦旋混勻器上混勻1min，8000r/min，離心10min，提取上層有機相于試管中，45℃氮氣吹干，殘留物以100μL甲醇溶液溶解，過0.25μm濾膜，取20μL進樣，按儀器工作條件進行測定，測得峰面積，計算回收率。

1.2.3 儀器工作條件

色譜柱：SHIMADZU VP-ODS（250mm×4.6mm，5μm），C18色譜柱，流動相：A：20mmol·L-1醋酸銨溶液（含0.1%甲酸，V/V），B：乙腈（梯度洗脫）。梯度洗脫程序：0～1min，A為90%，1～3min，A由90%降至10%，保持4.5min，7.5min～8min,A升至90%，保持3min。柱溫35℃、樣品室穩定20℃，1.0 mL·min-1（分流比4:1），進樣量20μL。質譜條件：電噴霧離子源（ESI）電噴霧電壓2500V，掃描模式為正離子模式（ESI＋），全掃描一級質譜，選擇離子二級掃描質譜檢查，離子源溫度120℃、去溶劑氣溫度40℃、毛細管電壓3.00kV，錐孔電壓15V、毛細管電壓3V，去溶劑氣流速750L·h-1，錐孔反吹氣流速50L·h-1。監測的離子對及碰撞能量參照國家標準物質中心提供的標準品質譜分析參數。

1.2.4 定性分析以及檢測方法的優化

在獲得待測樣品中的色譜峰后，根據標準對照品中的保留值，進行定性、改變容量因子K、離線結構分析。符合以下條件則可認為色譜峰與標準對照一致：①色譜峰保留時間與標準樣品一致；②峰面積有一定加標比例關系；③符合實驗室誤差限定標準范圍。根據《中華藥典》中有關毒品的溶解性，分別考察在10、15、20 min條件下甲醇對藥品的溶出度，設計正交試驗調節乙腈、水、甲酸、乙酸銨的濃度水平，建立二元溶劑體系，最終發現以乙腈提取的樣本的去干擾效果較差，背景干擾多，乙酸乙酯中性條件下回收率較低，加入0.1mol/L NaOH溶液，再提取，化合物回收率較高。原因是多數毒品為有機胺類化合物，在C18柱中的保留性會因為酸性條件下的電離子化而變差，在弱堿性條件下，化合物保留了分子形式，在C18柱上能夠得到更良好的保留。為降低樣本對質譜儀器的污染，通過在線切換閥處理，將目標化合物出峰前的溶液和待測組分流出色譜柱之后的溶液，切換至廢液中，盡量減少各種雜質對質譜的污染。根據對照標準品的裂解方式，選擇最高豐度離子作為檢測離子條件，最后繪制各類標準品多反應檢測總離子流量圖。

圖1 20種毒品標準品多反應檢測總離子流圖

2 結果

2.1 毒品的線性方程以及有效性驗證結果

精密度試驗采用同一份供試品溶液，連續進樣6次，相對保留時間RSD（%）在0.1～1.2之間，相對峰面積RSD（%）在0.8～2.9之間，均小于3%，精密度符合要求。

穩定性試驗采用同一份供試品溶液，記錄0、4、8、16、24h的色譜圖，連續進樣6次，相對保留時間RSD（%）在0.2～1.1之間，相對峰面積RSD（%）在0.9～2.8之間，均小于3%，樣本溶液24h內保持穩定精密度符合要求。

重現性試驗：取統一對象的血液樣本進行重復檢測6次，相對保留時間RSD（%）在0.1～1.2之間，相對峰面積RSD（%）在1.4～2.8之間，均小于3%，重現性良好。

回收率試驗，在陰性血液樣品中分別加入標準品使其達到1、2、5μg/kg的濃度水平，進行加標回收試驗，20種毒品的加標回收率在94～102%之間，符合檢測要求。

20種毒品的線性方程、相關系數、檢出限，回收率分別如下：①苯丙胺：y=7.50×105＋7.31×105x，0.996，2.0μg/kg，99.5%；②甲基苯丙胺：y=-0.60×106＋2.32×106x，0.994，2.0μg/kg，101.4%；③苯佐卡因：y=-1.56×105＋2.62×105x，0.998，，2.0μg/kg，95.6%；④3，4-亞甲基二氧基苯丙胺：y=3.90×105＋3.39×105x，0.994，2.0μg/kg，98.6%；⑤咖啡因：y=-4.66×104＋5.92×105x，0.999，2.0μg/kg，99.4%；⑥氯胺酮：y=1.29×106＋2.16×106x，0.991,4.0μg/kg，99.1%；⑦杜冷丁：y=4.21×106＋1.25×107x，0.993，1.0μg/kg，98.5%；⑧丁卡因：y=2.19×105＋3.98×105x，0.995，5.0μg/kg，95.6%；⑨安定：y= 3.59×106＋1.46×106x，0.994，2.0μg/kg，94.8%；⑩嗎啡：y=0.21×103＋2.97×104x，0.985，2.0μg/kg，95.6%；?去甲羥基安定：y=3.83×106＋1.98×106x，0.991，2.0μg/kg，99.1%；?舒樂安定：y=2.24×106＋3.04× 106x，0.990，4.0μg/kg，97.4%；?可待因：y=6.57×105＋5.90×105x，0.986，5.0μg/kg，97.3%；?利眠寧:y=1.12×105＋2.53×105x，0.987，2.0μg/kg，98.6%；?咪達唑侖:y=0.93×106＋3.06×106x，0.983，3.0μg/ kg，97.4%；?美沙酮:y=2.03×106＋3.54×106x，0.991，4.0μg/kg，97.9%；?蒂巴因:y=1.38×105＋2.96×105x，0.992，3.0μg/kg，98.5%；?四氫大麻酚:y=-2.17×104＋2.75×104x，0.972，2.0μg/kg，98.4%；?三唑侖:y=3.19×105＋2.45×106x，0.984，2.0μg/kg，96.8%；?氯氮平: y=1.07×106＋3.05×106x，0.991，2.0μg/kg，100.56%。20種毒品的線性方程相關性r在0.970以上，在1.0～100μg/kg之間呈現良好的線性關系，回收率在94～102%之間，檢出限1.0～5.0μg/kg，均符合要求。

20種毒品標準品多反應檢測總離子流圖見圖1，可見標準對照品離子峰顯現較好，無雜峰。

2.2 待測樣本以及健康人群檢出情況

健康人群檢出咖啡因陽性1例，正常人空白血液樣品色譜圖如下圖2。對吸毒人員的血樣進行檢驗，10份樣本全部檢出了毒品成分，嗎啡6例、苯佐卡因陽性3例、可待因2例、甲基苯丙胺1例、四氫大麻酚4例、去甲羥基安定5例，絕大多數檢出了多種毒品成分。圖3為檢出基苯丙胺的對象血液樣本色譜圖。

圖2 正常人空白血液樣品色譜圖

圖3 1例檢出甲基苯丙胺血液樣品色譜圖

3 討論

根據我國《刑法》第357條規定，毒品主要是指鴉片、海洛因、甲基苯丙胺（冰毒）、嗎啡、大麻等管制的能夠使人形成癮癖的麻醉藥物和精神藥物。通常而言，毒品可分為麻醉藥物與精神類兩類。在我國使用量較大的毒品主要是海洛因、甲基苯丙胺、嗎啡、大麻等。人在吸毒后，血液、尿液等代謝物中會存在毒品的原體以及代謝物，對這些物質進行含量檢測，能夠判斷人過去一段時間內是否有應用毒品的歷史。血液檢驗不同于尿液檢驗，獲得的樣本質量控制相對容易，同時原藥含量相對較高，檢驗機構采集樣本也更為容易，不容易受到腎臟功能等代謝因素的影響，在國際上血樣檢驗興奮劑的檢出率也遠高于尿液檢驗。血液毒品檢驗的方法較多，包括免疫學檢驗、薄層色譜、高效液相色譜，不同技術各有優劣，儀器聯用越來越受到重視。高液相色譜-質譜/質譜法檢測是應用最廣泛的聯用技術之一，可以應對層出不窮的新型毒品，依次分離、定性、定量分析，適合確證分析，而確證分析是吸毒史鑒定的最終目的。

高液相色譜-質譜/質譜法檢測可同時檢測血液樣本中的多種毒品成分殘留，本次研究建立了20種常見毒品殘留量色譜質譜聯合檢測體系。具有以下優勢：①可同時檢測，可進行成分檢測，具體分析毒品的種類，從而有針對性的分析當前吸毒情況，當然需注意的毒品本身在人體內可能會出現成分變化，需要做好藥理學分析[3]；②回收率、精密度較高優勢，相關系數均大于0.970，線性范圍1.0～100μg/kg，RSD均小于3%，檢出限1.0～5.0μg/kg,精密度實驗、穩定性、重現性試驗相對保留時間RSD（%）、相對峰面積RSD（%）均小于3%，符合試驗的要求，回收RSD在94～102%之間，回收率也較好，可有效的降低偏差，需注意的是，因毒品的種類較多，建立線性方程、有效性驗證過程中基礎工作量大。未進行檢測條件的優化，也需要進行關聯試驗，做好數據管理，從其他渠道獲得已有的數據資料，以縮短研究的過程中，提高測試整體效率。③有必要了解檢查地區的毒品檢測結果流行情況，對于分析毒品的來源，打擊毒品犯罪具有重要意義。

高效液相色譜-串聯質譜聯用技術檢測毒品方法不僅可用于人體樣本的檢測，還可用于藥物檢測。許多藥物如抗風濕類藥物、解熱鎮咳類藥物，可能會添加非法添加劑，其中不乏毒品，如咖啡因。另外許多毒品被用作醫療領域，如咪達唑侖是一種臨床常用的鎮定劑，也可用于醫療事故責任鑒定。

當然，本次研究目標毒品的數量僅為20類，實際上毒品的種類遠不止這些，且仍在不斷增多。當前，新的毒品層出不窮，制作販賣毒品的犯罪分子也在嘗試制作反檢測的毒品，采用常規的血液檢測技術檢出較困難。高效液相色譜-串聯質譜法測定相較于普通的色譜檢測等技術，靈敏性較好，即使是缺乏標準品，也能夠較容易的檢出異常的離子峰，對于新毒品的發現也有重要意義。需注意的是，無吸毒史人群也可能因用藥導致出現異常色譜峰、離子峰，需要慎重對待，做好數據的對比工作，避免誤檢[4]。為快速的檢出毒品的類型，實驗室還需加強信息建設，建立不同毒品的血液樣本濃度與檢測目標值之間的數據庫，必要時采用智能化的離子峰圖形匹配分析技術，快速進行檢測峰與數據庫中的毒品峰對照，快速分析毒品類型。再先進的技術，其檢驗的效果也會受到檢驗的質控水平影響，對于高液相色譜-質譜/質譜法檢測而言，選擇合適的樣本預處理非常重要，同時不同的毒品其性質不盡相同，不同的物質適合的檢驗條件不盡相同，這就要求需要對檢驗條件的優化，以提高檢驗的質量，今后有必要開展這方面的研究。

綜上所述，高效液相色譜-串聯質譜法可同時測定人血液中多種毒品殘留，結果準確可靠。

[1]聯合國毒品犯罪局.2012世界毒品報告[R].2012.

[2]邸玉敏,朱軍,常靖,等.GC/MS、GC/NPD法檢測血液中氯胺酮[J].中國法醫學雜質,2010,25（3）:169-171.

[3]張睿,王海濤,吳斌,等.高效液相色譜-串聯質譜法檢測人血液中常見毒品殘留量[J].分析試驗室,2011,30（10）:71-74.

[4]M.Cruz-Vera,R.Lucena,S.Ca′rdenas,et al.Sorptive microextrac?tion for liquid-chromat ographic determination of drugs in urine[J]. Trends in Analytical Chemistry,2009,28（10）:1164-1173.