氨甲酰化促紅細胞生成素對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及cleaved Caspase-3蛋白表達的影響

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氨甲酰化促紅細胞生成素對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及cleaved Caspase-3蛋白表達的影響

黃兆琦1，伍金雷1，許衛1，陳永權1，謝文杰1，陳晞明1，陳盛強2

目的觀察氨甲酰化促紅細胞生成素(CEPO)對慢性心力衰竭(CHF)大鼠心功能、心肌細胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白活化表達的影響。方法將30只雄性成年SD大鼠隨機分為假手術(Sham)組(n=10)、CEPO組(n=10)和對照(Control)組(n=10)，采用腹主動脈縮窄術制作慢性心力衰竭模型，術后第8周CEPO組開始經腹腔注射50 μg/kg CEPO，3次/周，連續4周；Sham組、Control組同期經腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。術后第8周、12周行心臟彩超檢測大鼠心功能。術后第12周末取大鼠心肌組織切片采用HE染色法觀察心肌組織細胞形態；采用原味缺口末端標記(TUNEL)法檢測心肌細胞凋亡及計算凋亡指數(AI)；采用Western blot印跡法檢測心肌活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白表達水平。結果與假手術組相比，建模大鼠術后第8周時出現心室肥厚及左室射血分數(LVEF)減退；CEPO組干預4周后左室射血分數較Control組明顯升高(P<0.05)，收縮末期室間隔厚度(IVSs)、收縮末期左心室后壁厚度(LVPWs)、舒張末期室間隔厚度(IVSd)、舒張末期左心室后壁厚度(LVPWd)明顯降低(P<0.05)。與Control組比較，CEPO組AI值顯著降低[(23.87±1.45)% vs(30.15±0.67)%，P<0.05]，cleaved Caspase-3表達水平(0.489 1±0.029 1)明顯減少(P<0.01)。結論CEPO可通過抑制凋亡關鍵酶Caspase-3的活化，顯著減少cleaved Caspase-3蛋白的表達水平，減少心肌細胞凋亡以改善心功能。

心力衰竭；氨甲酰化促紅細胞生成素；心肌凋亡；活化型Caspase-3蛋白

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是一種復雜的臨床癥候群，發病率和病死率高，5年生存率與惡性腫瘤相仿，嚴重威脅著病人的生命[1]。終末期充血性心力衰竭病人心臟中長期的壓力負荷過重致使心肌細胞數目的減少及心肌組織纖維增生，是引起心肌舒縮功能障礙的主要原因之一。而有實驗證明心肌細胞的減少主要是因為心肌細胞凋亡所致[2]。有研究證實：促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)具有抗凋亡、抗炎、抗氧化作用，并對心、腦、脊髓等臟器均具有明顯的細胞保護作用，是近來國內外研究的熱點[3]。亦有新近研究指出EPO的衍生物氨甲酰化促紅細胞生成素(carbamylated erythropoietin，CEPO)具有與EPO近乎同等的組織保護作用，不會促進造血，從而減少了血液淤積、血壓升高、血栓形成等不良反應的發生，具有更廣闊的臨床應用前景[4]。但就目前而言，CEPO治療CHF的相關研究尚少見報道。本研究通過建立大鼠CHF模型并予以CEPO干預，觀察心臟功能指數、心肌細胞組織形態、心肌細胞凋亡率以及凋亡相關基因活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白的表達，探討CEPO調節Caspase-3活化表達對CHF大鼠的心肌保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 8周～12周齡SPF級成年雄性SD大鼠共36只，體重(235.26±10.15)g，購自南方醫科大學實驗動物中心。所有大鼠均在相同的條件下飼養，自由飲水和取食。飼料購自南方醫科大學實驗中心。

1.1.2 藥品及試劑 CEPO由廣州醫科大學藥學研究室合成，TUNEL試劑盒購自Roche公司，β-actin抗體購自ProteinTech Group，Inc(USA)，cleaved Caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology(USA)。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型建立 36只成年雄性SD大鼠隨機選取10只為假手術(Sham)組，其余大鼠行腹主動脈縮窄術建立CHF模型。手術前禁食24 h并稱重，10%水合氯醛(3 mL/kg)經腹腔注射麻醉，逐層打開腹腔、暴露左腎靜脈，取左腎靜脈和下腔靜脈交點上方15 mm～20 mm處鈍性分離筋膜后暴露腹主動脈，用4-0絲線穿過分離的腹主動脈，在腹主動脈上平行放置磨鈍后的7號輸液針頭(直徑0.7 mm)，結扎絲線后馬上拔除針頭，拔針時以稍有緊箍感為宜，此時可使腹主動脈縮窄達60%～70%，收納臟器，逐層關閉腹腔。待大鼠從麻醉中蘇醒后即經腹腔注射阿米卡星(0.2 mL/d)抗感染，連續3 d。術后正常飼養并觀察8周，制成CHF模型。Sham組在分離的腹主動脈相同部位穿線但不結扎，余建模流程同上。

1.2.2 模型分組和干預 術后第8周，將造模成功的存活CHF大鼠用隨機數字表法平均分為CEPO組(n=10)和Control組(n=10)，其中CEPO組大鼠經腹腔注射CEPO(50 μg/kg)，3次/周，連續4周[4]。Control組及Sham組大鼠經腹腔同期注射等量0.9%氯化鈉溶液。給藥期間各組大鼠無死亡。

1.2.3 心臟彩超檢查 在術后第8周、12周行心臟彩超觀察大鼠心功能。大鼠禁食24 h后，10%水合氯醛經腹腔注射(3 mL/kg)麻醉、備皮并仰臥位固定，應用超聲心動儀(ie33型號，PHILIPS公司)及7.5 MHz高頻線控探頭(PHILIPS公司)進行心臟功能檢測。分別檢測左室射血分數(LVEF)、舒張末期室間隔厚度(IVSd)、舒張末期左心室后壁厚度(LVPWd)、收縮末期室間隔厚度(IVSs)、收縮末期左心室后壁厚度(LVPWs)。

1.2.4 心肌組織處理 術后第12周末待全部大鼠完成心臟彩超檢測后，10%水合氯醛(3 mL/kg)經腹腔注射麻醉，暴露胸腔，剔除心外膜，剪取心尖部5 mm×5 mm×5 mm心肌組織，放入預冷至4 ℃的PBS溶液中沖洗至溶液澄清，置于液氮中速凍后存于-80 ℃超低溫冰箱，待分子生物學實驗使用；左心室插管至主動脈并固定，剪開右心耳，以預冷至4 ℃的生理鹽水溶液快速灌流約3 min至右心耳流出無色澄清液體，再以4%多聚甲醛溶液灌注固定20 min～30 min后剪取心臟，置于4%多聚甲醛緩沖液固定24 h，常規制備石蠟切片，厚度3 μm～4 μm，待用。

1.2.5 病理檢查 從經上述步驟制成的石蠟切片中，每組隨機選擇3張切片，采用蘇木精-伊紅(HE)染色后置于200 倍光鏡下觀察各組心肌組織細胞形態結構及炎癥細胞浸潤情況。

1.2.6 TUNEL原位末端標記法檢測細胞凋亡 從石蠟切片中，每組隨機選擇3張切片，按照TUNEL試劑盒操作說明處理，在鏡下觀察陽性凋亡細胞并攝取圖像，再進行DAB染色，每張切片在高倍鏡(×400)下隨機讀取6個不重疊視野，細胞核染成深棕色者計為陽性細胞。計數后，計算細胞凋亡指數(AI)=單視野凋亡陽性細胞數/單視野總細胞計數×100%，取其平均值進行統計分析。

1.2.7 Western blot法測定cleaved Caspase-3蛋白表達 心肌組織經研磨、裂解后用酶標儀測定蛋白濃度，上樣總蛋白質量定為120 μg，經SDS-PAGE凝膠電泳分離后，采用電印跡轉移法，將目標蛋白轉至PVDF膜，再用麗春紅S染色，根據所需目標分子量剪膜，用含5%脫脂奶粉的TBS-T溶液在室溫中封閉2 h后，分別加入兔抗Caspase-3抗體和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，在室溫下用TBS-T溶液洗膜，充分洗膜后加入兔(鼠)二抗孵育2 h，用TBS-T溶液洗膜后與ECL試劑反應5 min，膠片曝光并掃描圖像，用Quantity One軟件計算條帶光密度(OD)值，以cleaved Caspase-3與β-actin條帶的OD積分比值來評定的cleaved Caspase蛋白的表達水平。

2 結 果

2.1 心臟彩超結果 術后第4周，Sham組與建模組大鼠LVEF差異無統計學意義(P>0.05)；建模組LVPWd、IVSd、LVPWs、IVSs顯著升高(P<0.05)，表明Control組大鼠心臟發生心肌肥厚。術后第8周，Control組大鼠LVEF顯著下降(P<0.05)，LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd仍高于Sham組(P<0.05)，表明Control組大鼠經結扎縮窄腹主動脈后發生心力衰竭，CHF模型建立成功。術后第12周，相比Sham組(見圖1A)，Control組大鼠LVEF進一步下降(P<0.05)，LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd進一步增高(P<0.05)，詳見圖1B。側面反映Control組大鼠心力衰竭進一步加重。與Control組比較，EPO組大鼠LVEF明顯增加(P<0.05)，LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd明顯降低(P<0.05)，表明EPO干預CHF大鼠能夠逆轉其心室肥厚、改善心功能。詳見圖1C、表1。

圖1各組大鼠超聲心動圖

組別時間nLVPWs(cm)IVSs(cm)LVPWd(cm)IVSd(cm)LVEFSham組8周100.285±0.0210.268±0.2620.194±0.1550.163±0.1470.897±0.57312周100.321±0.0150.295±0.0230.207±0.0100.185±0.0950.882±0.451Control組8周100.393±0.0161)0.349±0.4201)0.295±0.2471)0.227±0.2310.731±0.1911)12周100.451±0.0121)0.372±0.0101)0.309±0.0101)0.304±0.0201)0.643±0.2981)CEPO組12周100.367±0.1112)0.326±0.232)0.245±0.0202)0.217±0.0102)0.782±0.3451)2) 與同期Sham組比較,1)P<0.05;與Control組比較,2)P<0.05。

2.2 HE染色結果 Sham組大鼠心肌細胞染色清晰、排列整齊而緊密，結構完整，細胞核致密、清晰可見，呈橢圓形或長桿形，顯藍色。Control組心肌細胞較肥大，細胞間間隙增寬，排列紊亂，可見間質增生、纖維化，細胞核著色不均，心肌肌節增多、肌纖維間疏松水腫。相比Control組，CEPO組心肌細胞排列紊亂、間質增生水腫及炎性細胞浸潤、聚集的表現有所減輕。詳見圖2。

Sham組 Control組 CEPO組

2.3 心肌細胞凋亡的變化 Sham組細胞核染為藍色，清晰可見，邊界清楚。Control組可見大量棕色深染的固縮、聚集呈棒狀的細胞核(箭頭所示)，為發生凋亡的細胞核。EPO組深染棕色細胞核較Control組明顯減少。詳見圖3。與Sham組比較，Control組AI顯著升高；與Control組比較，CEPO組AI相對下降，但仍高于Sham組(P<0.05)。詳見表2。

圖3 光鏡下心肌細胞凋亡組織切片(TUNEL，×400)

2.4 Western blot法檢測心肌cleaved Caspase-3蛋白表達 與Sham組比較，Control組cleaved Caspase-3/β-actin OD值明顯升高；CEPO組cleaved Caspase-3 OD值相比Control組顯著降低，但高于Sham組(P<0.05)。詳見圖4、表2。

圖4 Western blot檢測各組大鼠術后第12周心肌cleaved Caspase-3蛋白的表達

組別ncleavedCaspase-3/β-actinAI(%)Sham組100.3042±0.00178.91±0.18Control組100.9021±0.04141)30.15±0.671)CEPO組10 0.4891±0.02911)2) 21.33±2.531)2) 與同期Sham組比較,1)P<0.05;與Control組比較,2)P<0.05。

3 討 論

近年來不斷有研究證實[5-6]，細胞凋亡作為一種有別于細胞壞死的程序性死亡現象，在慢性心力衰竭發生、發展過程中扮演著重要的角色。心肌細胞屬于終末分化細胞，在病理過程中心肌細胞凋亡程序被激活時，大量心肌細胞死亡可造成數量永久減少，當數量減少至某一閾值時存活的心肌細胞不足以完全代償維持心臟正常的舒縮功能，引致心室壁變薄、心肌肥大、心腔擴大等器質性病變，最終發展為心力衰竭。和非心肌細胞類似，心肌細胞凋亡發生的信號傳導通路主要有兩條[7]：一條是通過胞外信號激活細胞內的Caspase家族蛋白酶，一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子使Caspase家族蛋白酶活化。這些活化的Caspase家族蛋白酶可將細胞內的重要蛋白降解，最終引起細胞凋亡。由此可見這兩條凋亡途徑共同的關鍵環節是Caspase家族蛋白酶的激活。Caspase家族是一組同型半胱氨酸門冬氨酸蛋白酶，通過蛋白酶級聯反應順序激活，在細胞凋亡的執行過程中起著關鍵作用，其中Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執行因子，它由28 kD的酶原經酶解作用生成由17 kD、12 kD 兩個亞單位組成的異二聚體，是細胞凋亡早期階段激活的關鍵蛋白酶，在細胞凋亡過程中起中心環節作用，故也被稱為死亡蛋白酶，是目前已知的凋亡最終執行因子[8]。以往的研究顯示：Caspase-3通常以無活性的 Caspase-3前體(pro Caspase-3)存在的，當細胞受到凋亡信號激活或各種外界有害物質刺激時，Caspase-3轉變為有活性的Caspase-3，又稱為活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)，活化型Caspase-3具有成熟酶的性質，標志著細胞凋亡進入不可逆階段。其主要作用機制是消化破壞細胞內多種蛋白酶復合體，激活核內核酸酶，造成DNA裂解，形成DNA片段，破壞細胞鈣泵功能，發生細胞內鈣超載，導致最終的細胞凋亡[9]。

從本研究結果可以看出，CHF建模成功的Control組大鼠在術后第12周時行western蛋白印跡檢測觀察到cleaved Caspase-3蛋白表達水平較Sham組顯著升高(P<0.05)，與此同時TUNEL檢測可觀察到Control組大鼠凋亡細胞數量較Sham組明顯增加(P<0.05)。心臟彩超檢測結果也顯示，相比假手術組，術后第12周Control組大鼠的心室肌明顯肥厚，射血分數顯著下降(P<0.05)，提示CHF大鼠心室重塑、心臟舒縮功能下降，發生心力衰竭。這和以往的相關研究結果一致[10]。因此，阻斷心肌細胞凋亡的信號轉導通路，抑制Caspase-3活化，減少cleaved Caspase-3表達水平有助于阻遏凋亡的發生，這將是今后防治心力衰竭的主要途徑之一。

傳統的CHF治療藥物包括血管緊張素轉換酶抑制劑、β受體阻斷劑、利尿劑及強心苷類藥物等。但上述藥物均各自存在藥物不良反應和療效不佳的問題，因此，尋找出一種更廣泛適用的抗慢性心力衰竭藥物是國內外研究的熱點。EPO是一種由腎臟(少量來自于肝臟)合成和分泌的糖蛋白生長因子，主要治療腎性貧血。新近研究證實，EPO在心血管疾病上發揮著細胞保護作用，這些有利作用的機制仍尚未可知，但可能和抗凋亡、抗氧化、促進新生血管生成有關[11]。但是，EPO發揮細胞保護的劑量要遠遠大于治療貧血時的劑量，長期大劑量應用EPO可能造成對骨髓造血系統的過度刺激，進而導致紅細胞增多癥、高血壓及血栓形成等不良作用。因此，在保留EPO細胞保護功能的前提下去除其促紅細胞生成作用的衍生物研發是近期研究的熱點之一。Leist[12]通過用KCNO使EPO氨甲酰化的化學方法制成了CEPO。與EPO相比，CEPO并沒有促紅細胞生成的作用，但具有與EPO相似的藥物代謝動力學特性，同時有研究報道CEPO具有與EPO相同的細胞保護作用。

本研究制備了CHF大鼠模型并予以CEPO干預，探討CEPO對CHF大鼠心肌的保護作用。結果顯示：相比對照組，經CEPO干預的CHF大鼠心肌細胞凋亡的數量明顯減少，心肌組織cleaved Caspase-3蛋白表達水平下降。提示CEPO能減少關鍵凋亡酶蛋白Caspase-3的活化，抑制具有生物功能的cleaved Caspase-3產生，從而減少了心肌凋亡的數量并起心肌細胞保護作用，對CHF的治療發揮著積極的作用。然而，CEPO減輕心肌凋亡的具體機制及是否存在其他遠期不良反應尚未闡明，有待進一步研究。

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(本文編輯郭懷印)

Effects of Carbamylated Erythropoietin on the Apoptosis and Cleaved Caspase-3 Protein in Rat with Chronic Heart Failure

Huang Zhaoqi，Wu Jinlei，Xu Wei，Chen Yongquan，Xie Wenjie，Chen Ximing，Chen Shengqiang

The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510150，China

ObjectiveTo observe the effects of cardiomyocytes carbamylated erythropoietin (CEPO) on the cardiac function,the apoptosis of cardiomyocytes，protein cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases (cleaved Caspase-3) expression in rats with chronic heart failure(CHF).MethodsFirstly，30 male adult SD rats were randomly divided into three groups，sham-operated (Sham) group (n=10)，CEPO group (n=10) and control (Control) group (n=10).CHF model was built by abdominal aortic coarctation.After postoperative eight weeks，rats in CEPO group

50 μg / kg CEPO by intraperitoneal injection 3 times / week for 4 weeks.The rats in Sham group and Control group received equal normal saline.Respectively，after 8 weeks and 12 weeks，cardiac function was observed with echocardiography.After 12 weeks，all rats were sacrificed，cell morphology was observed by HE staining.The myocardial apoptosis and calculated apoptosis index (AI)；was observed Myocardial cleaved Caspase-3 protein expression was observed by western blot.ResultsEchocardiography showed CHF rats had ventricular hypertrophy and heart failure in 8 weeks.CEPO intervention after 4 weeks compared with Control group，left ventricular ejection fraction (LVEF) was significantly higher (P<0.05)，systolic interventricular septum thickness (IVSs)，end-systolic left ventricular posterior wall thickness (LVPWs)，diastolic interventricular septum thickness (IVSd)， left ventricular end-diastolic wall thickness (LVPWd) was significantly lower (P<0.05).AI in CEPO group was significantly lower than that in Control group[(23.87±1.45)% vs(30.15±0.67)%，P<0.05].The cleaved Caspase-3 OD values significantly decreased in CEPO group (0.489 1±0.029 1) with Control group (P<0.01).ConclusionCEPO can improve heart function in rats with CHF the cardiomyocyte apoptosis，by down-ragulating the express of cleaved Caspase-3 protein.

heart failure；carbamylated erythropoietin；cardiac apoptosis；cleaved Caspase-3 protein

廣東省科技廳基金項目(No.2013B022000103)

1.廣州醫科大學附屬第三醫院(廣州 510150)，E-mail：huangzhaoqi34@163.com；2.廣州醫科大學附屬第二醫院

信息：黃兆琦，伍金雷，許衛，等.氨甲酰化促紅細胞生成素對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及cleaved Caspase-3蛋白表達的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(16)：1974-1978.

R541.6 R256.2

：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.16.007

：1672-1349(2017)16-1974-05

2017-03-13)