阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征模型大鼠心肌氧化應(yīng)激的損傷及復(fù)氧后的變化

田培燕，陳應(yīng)康，謝福珊，楊順茂

（黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校1.生理教研室，2.病理學(xué)教研室 貴州 黔南 558000；3.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 老年科 貴州 黔南 558099）

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征模型大鼠心肌氧化應(yīng)激的損傷及復(fù)氧后的變化

田培燕1，陳應(yīng)康2，謝福珊1，楊順茂3

（黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校1.生理教研室，2.病理學(xué)教研室 貴州 黔南 558000；3.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 老年科 貴州 黔南 558099）

目的通過(guò)復(fù)制阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（OSAHS）的間歇缺氧（IH）大鼠模型，觀察IH對(duì)大鼠心肌氧化應(yīng)激的損傷及其復(fù)氧后的變化情況。方法40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組（A組）10只，復(fù)制30只阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的間歇缺氧大鼠模型，其中10只缺氧組（B組），10只缺氧后復(fù)氧組（C組），另外10只持續(xù)缺氧組（D組）。檢測(cè)各組大鼠血清中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，以及心肌組織中還原型谷胱甘肽（GSH）活性。結(jié)果與對(duì)照組大鼠比較，IH模型大鼠MDA含量增高，SOD活性降低，心肌組織GSH活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；復(fù)氧組大鼠MDA、SOD和心肌組織GSH活性恢復(fù)正常，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而D組大鼠MDA含量增高，SOD活性降低，心肌組織GSH活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論OSAHS存在氧化應(yīng)激，嚴(yán)重?fù)p傷心肌組織，缺氧時(shí)MDA含量、SOD和GSH活性改變，復(fù)氧后有所恢復(fù)。血清MDA含量、SOD活性及心肌組織GSH活性可以反應(yīng)氧化應(yīng)激的嚴(yán)重程度。

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征；間歇缺氧；持續(xù)缺氧；心肌氧化應(yīng)激

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea hyperpnoea syndrome，OSAHS），是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)性呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病率日趨升高，日益受到醫(yī)學(xué)界的重視[1-2]。OSAHS是指患者在睡眠時(shí)引發(fā)通氣不足和呼吸暫停，伴隨睡眠結(jié)構(gòu)紊亂、打鼾等，繼而引發(fā)一系列生理病理改變和臨床并發(fā)癥[3-4]。OSAHS患者多表現(xiàn)為白天嗜睡，夜間反復(fù)發(fā)生低氧血癥和高碳酸血癥，睡眠時(shí)打鼾并伴有呼吸淺表和呼吸暫停。OSAHS患者在呼吸暫停、組織缺氧后，又發(fā)生高通氣血氧恢復(fù)，該過(guò)程產(chǎn)生過(guò)多的氧自由基進(jìn)而改變氧平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）發(fā)生，氧化和抗氧化能力失衡[5-6]。研究證實(shí)諸多疾病的發(fā)生發(fā)作都與OS相關(guān)，尤其與心血管疾病有密切聯(lián)系。因此，本研究復(fù)制OSAHS的間歇缺氧（intermittent hypoxia，IH）大鼠模型，探討是否存在氧化應(yīng)激及其可能導(dǎo)致的損傷。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只清潔級(jí)雄性SD大鼠（由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供），體重200～220 g，隨機(jī)分為 4組，即對(duì)照組（A 組）、缺氧組（B組）、缺氧復(fù)氧組（C組）和持續(xù)缺氧組（D組），每組10只。所有動(dòng)物均由統(tǒng)一飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 戊巴比妥鈉購(gòu)自北京普博斯生物科技有限公司，青霉素購(gòu)自山西振東泰盛制藥有限公司，丙二醛（Malonaldehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物模型的復(fù)制

選用一個(gè)長(zhǎng)方體箱，在側(cè)壁中央取兩個(gè)孔，分別輸入空氣和氮?dú)狻Ｔ僭趦啥思皟蓚?cè)壁取小孔，便于氣體采樣和平衡艙內(nèi)壓力。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用生石灰和硅膠干燥劑吸收艙內(nèi)CO2和水蒸氣。每天10∶00～18∶00將B組、C組和D組大鼠放置于低氧艙內(nèi)，關(guān)閉艙門，間歇性地向艙內(nèi)充入壓縮空氣和氮?dú)猓?0 s充入氮?dú)猓S后30 s充入壓縮空氣，以此60 s循環(huán)一次。采用測(cè)氧儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)艙內(nèi)氧濃度，調(diào)節(jié)氣體流量，保證每次循環(huán)時(shí)艙內(nèi)的最低氧濃度為4%～6%，之后逐步恢復(fù)至21%。如此持續(xù)30 d即成功復(fù)制大鼠OSAHS模型。中間隨機(jī)取B組大鼠靜脈血和心肌組織送檢。C組大鼠取出低氧艙后正常飼養(yǎng)30 d，取靜脈血和心肌組織送檢。D組大鼠繼續(xù)依照上述方法在低氧艙內(nèi)處理30 d，隨后抽取靜脈血和心肌組織送檢。

1.3 標(biāo)本采集和處理

1.3.1 檢測(cè)血清MDA含量和SOD活性 各組大鼠均抽取靜脈血2 ml送檢。所得靜脈血在1 800 r/min下離心10 min后獲取血清，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)MDA含量和SOD活性。SOD活性采用鄰苯三酚自氧化法檢測(cè)，MDA含量采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)。

1.3.2 檢測(cè)心肌組織GSH活性 各組大鼠取心肌組織0.5 g送檢。將心肌組織放入清水中洗凈，濾紙吸干，稱重后剪碎勻漿，以3 500 r/min低溫離心15 min。取上清液用以檢測(cè)GSH酶活性。按照試劑盒說(shuō)明書采用比色法測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本間差異比較采用方差分析，組間兩兩比較采用F檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為變化

復(fù)制模型成功后觀察大鼠的行為變化，大鼠在白天即表現(xiàn)出精神不佳，反應(yīng)遲鈍的情況，在夜間睡眠時(shí)打鼾（類似于喉鳴音）、呼吸暫停伴隨胸腹式反常呼吸運(yùn)動(dòng)。對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)上述情況。

2.2 血清M D A含量及SO D活性

4組大鼠血清MDA含量和SOD活性見(jiàn)表1。結(jié)果表明，與A組大鼠比較，B組大鼠MDA含量增高，SOD含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組大鼠MDA和SOD含量恢復(fù)正常，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；D組大鼠MDA含量增高，SOD含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 心肌組織G SH活性

4組大鼠的心肌組織GSH活性見(jiàn)表2。結(jié)果表明，與A組大鼠比較，B組大鼠心肌組織GSH活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組大鼠心肌組織GSH活性恢復(fù)正常，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；D組大鼠心肌組織GSH活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 4組大鼠血清M D A和SO D值比較 （n=10，±s）

表1 4組大鼠血清M D A和SO D值比較 （n=10，±s）

組別P值A(chǔ)組 3.09±0.51 443.08±32.19 B 組 3.91±0.61 3.261 0.004 381.51±28.74 4.512 0.000 MDA/（μmol/g）F值P值SOD/（IU/g）F值C組D組3.21±0.54 4.52±0.87 0.511 4.484 0.615 0.000 438.11±31.52 337.56±31.32 0.349 7.430 0.731 0.000 F值 8.256 12.291 P值 0.000 0.000

表2 4組大鼠心肌G SH水平比較 （n=10，±s）

表2 4組大鼠心肌G SH水平比較 （n=10，±s）

組別F值50.21±9.32 40.37±6.12 2.791 C組P值A(chǔ)組B組0.012 GSH/（μmol/g）48.75±8.62 0.364 D組 32.78±5.98 4.978 0.000 F值 8.115 P值 0.000 0.720

3 討論

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征具有高發(fā)病率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人體多個(gè)系統(tǒng)，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。國(guó)外發(fā)病率約為2%～4%，國(guó)內(nèi)發(fā)病率約為3.5%～4.8%，其中，中老年人群中患病率隨年齡的增加而增高。OSAHS的病理學(xué)特征為睡眠高阻力性呼吸。睡眠時(shí)胸腔負(fù)壓增大，咽部擴(kuò)張肌收縮活動(dòng)減弱，進(jìn)一步加重上氣道解剖狹窄，直至完全閉合。目前，針對(duì)OSAHS研究的常用復(fù)制模型方法包括單純間歇性改變氧濃度、偶發(fā)缺氧、低壓低氧誘導(dǎo)、限制通氣、上氣道機(jī)械壓力性震動(dòng)、氣管阻塞、睡眠剝奪等。OSAHS動(dòng)物模型尚無(wú)公認(rèn)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，主要觀察動(dòng)物模型和人類OSAHS疾病的特征是否符合，指標(biāo)包括[7]：①癥狀：鼻鼾、睡眠紊亂、呼吸暫停等；②咽部解剖結(jié)構(gòu)：咽腔徑線、咽壁軟組織、咽部肌肉電生理情況；③多導(dǎo)睡眠圖（Polysomnography，PSG）：動(dòng)物呼吸紊亂指數(shù)和睡眠分期。目前認(rèn)為，檢測(cè)PSG是OSAHS診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”：每晚7 h睡眠中反復(fù)發(fā)作呼吸暫停和低通氣30次以上，或睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)（AHI）≥5次/h即可確診。

OSAHS患者引發(fā)心血管疾病的主要病理過(guò)程是缺氧、高碳酸血癥等因素持續(xù)存在，導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮異常增強(qiáng)，其中，呼吸氣流停止反復(fù)發(fā)作引起的IH是最核心原因。缺血/低氧階段，細(xì)胞自我調(diào)節(jié)以適應(yīng)低氧環(huán)境；再灌注/復(fù)氧階段，細(xì)胞內(nèi)氧氣含量急劇增加，該現(xiàn)象稱之為缺氧/再氧合（hypoxia/reoxygenation），導(dǎo)致ROS生成，促進(jìn)氧化應(yīng)激發(fā)生。OSAHS患者的嚴(yán)重程度與氧化應(yīng)激的發(fā)生密切相關(guān)[8]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在受到有害刺激時(shí)，體內(nèi)的高活性分子過(guò)度生成，氧化程度超出了氧化物的清除能力，氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致機(jī)體損傷[9-10]。氧化應(yīng)激可由若干標(biāo)志物的含量來(lái)反應(yīng)，主要包括脂質(zhì)過(guò)氧化物，氧化蛋白，如MDA、SOD、GSH等。

本研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS復(fù)制模型成功后，大鼠MDA含量增高，SOD活性降低，心肌組織GSH活性降低，表明反復(fù)的阻塞性呼吸暫停會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，使氧化和抗氧化作用失衡，從而引起一系列生理過(guò)程異常。大鼠在復(fù)氧后MDA含量、SOD活性和心肌組織GSH活性恢復(fù)正常，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。持續(xù)缺氧大鼠MDA含量增高，SOD活性降低，心肌組織GSH活性降低，表明大鼠心肌功能已嚴(yán)重受損。究其原因可能是：持續(xù)性缺氧導(dǎo)致中性粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，變形性降低，引起中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集、激活，大量活性氧由此釋放，從而嚴(yán)重?fù)p傷組織和細(xì)胞。

OSAHS患者在睡眠中由于反復(fù)上氣道阻塞的發(fā)生，多數(shù)會(huì)出現(xiàn)間斷的缺氧和復(fù)養(yǎng)過(guò)程，這類似于缺血過(guò)程中的再灌注過(guò)程中出現(xiàn)的病理性改變，產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，從而引起機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)的改變。本研究中成功復(fù)制了阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征大鼠模型，觀察到了IH對(duì)大鼠心肌氧化應(yīng)激的損傷及其復(fù)氧后的變化情況，對(duì)于阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的發(fā)病機(jī)制有了清晰的認(rèn)識(shí)，可幫助找到治療人類OSAHS患者的突破點(diǎn)，對(duì)于預(yù)防和治療阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征有著一定的臨床指導(dǎo)意義。

綜上所述，OSAHS存在氧化應(yīng)激，嚴(yán)重?fù)p傷心肌組織，缺氧時(shí)MDA含量、SOD和GSH活性改變，而復(fù)氧后恢復(fù)。血清MDA含量和SOD活性及心肌組織GSH活性可以反應(yīng)氧化應(yīng)激的嚴(yán)重程度。

參 考 文 獻(xiàn)：

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（張蕾 編輯）

Myocardial oxidative stress injury and changes after reoxygenation in rat model of obstructive sleep apnea syndrome

Pei-yan Tian1,Ying-kang Chen2,Fu-shan Xie1,Shun-mao Yang3
(1.Department of Physiology,2.Department of Pathology,Qiannan Medical College for Nationalities,Qiannan,Guizhou 558000,China;3.Department of Geriatrics,the Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Qiannan,Guizhou 558099,China)

ObjectiveTo establish obstructive sleep apnea syndrome(OSAHS)rat model by intermittent hypoxia(IH)and to observe the myocardial oxidative stress injury and changes after reoxygenation.MethodsIn this study,10 untreated rats were enrolled into control group(group A).Through 30-d IH,obstructive sleep apnea syndrome model was established in 30 rats.among which 10 rats had examination of venous blood and myocardial tissues just after model establishment(group B),10 rats had reoxygenation immediately after model establishment(group C)and their venous blood and myocardial tissues were examined after 30-d normal feeding,still 10 rats had IH for additional 30 days (group D)before examination of their venous blood and myocardial tissues.The content of serum malondialdehyde(MDA),the activity of serum superoxide dismutase(SOD),and the activity of glutathione(GSH)in myocardial tissue were detected and compared between the groups.ResultsCompared with the group A,the serum MDA content increased,the serum SOD activity and the activity of glutathione(GSH)in myocardial tissue decreased in the group B (P＜0.05);the indexes returned to normal in the group C (P＞0.05);however,in the group D,the myocardial GSH activity and the serum SOD activity were significantly decreased,and the serum MDA content was significantly increased(P＜0.05).ConclusionsOxidative stress appears in OSAHS,and causes severe injury ofmyocardial tissue.Hypoxia can change MDA content,and SOD and GSH activity which will recover after reoxygenation.Hence,serum MDA content and SOD and GSH activity can reflect the severity of oxidative stress in myocardial tissues.

obstructive sleep apnea syndrome;intermittent hypoxia;rat;myocardial oxidative stress injury

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.005

1005-8982（2017）13-0024-04

2016-11-30