TNF-α和IL-10基因多態性及其血漿濃度與彌漫大B細胞淋巴瘤的關系

沈 艷，顧 霞，富 玲，鄒紅云，石雨薇

·論 著·

TNF-α和IL-10基因多態性及其血漿濃度與彌漫大B細胞淋巴瘤的關系

沈 艷1，顧 霞2，富 玲3，鄒紅云4，石雨薇5

目的探討TNF-α和IL-10基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)、血漿濃度與彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)三者之間的關系。方法采用SNaPshot SNP分型技術檢測38例DLBCL患者及77例健康對照者TNF-α和IL-10基因6個位點SNPs，并應用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測定血漿TNF-α和IL-10濃度。結果DLBCL組血漿IL-10水平明顯高于對照組(P<0.05)，TNF-α水平在兩組間差異無明顯相關性(P>0.05)。在8個候選的SNPs位點中，TNF-α-863C/A多態性分布在DLBCL組和對照組間差異有顯著性，其中CA/AA基因型攜帶者罹患DLBCL的風險為CC基因型的2.280倍(95%CI=1.091～4.765，P=0.028)，其余7個SNPs多態性分布在兩組間差異均無顯著性(P>0.05)。在排除患病狀況對血漿TNF-α和IL-10水平的影響后，各基因多態性對其相應血漿濃度均無明顯影響(P>0.05)。結論TNF-α-863C/A位點多態性與DLBCL易感性有關，IL-10可能在DLBCL發生、發展中起重要作用。

：彌漫大B細胞淋巴瘤；TNF-α；IL-10；單核苷酸多態性；酶聯免疫吸附法

細胞因子是一類由活化的淋巴細胞或相關基質細胞分泌的小分子蛋白，具有多種生物學功能，在炎癥及免疫反應等方面發揮重要調控作用。近年研究發現多種免疫相關細胞因子及其基因多態性與淋巴瘤發生及預后有關。彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)最常見亞型，占30%～40%；在組織形態學、免疫表型、遺傳學及臨床特征上具有高度的異質性[1]，其發病機制目前尚不清楚。本文著重探討細胞因子TNF-α和IL-10基因多態性、血漿濃度與DLBCL之間的相關性及臨床意義，以提高認識水平。

1 材料與方法

1.1材料收集新疆醫科大學第一、二附屬醫院2010年1月～2011年12月經病理確診的 DLBCL患者38例，參照WHO(2008)淋巴組織腫瘤分類標準診斷，根據霍奇金淋巴瘤Ann Arbor分期系統進行分期。對照組為同期健康體檢者77例。所有分析對象近半年內未服用過免疫調節劑和激素類藥物。

1.2試劑TNF-α和IL-10試劑盒(上海藍基公司)，引物、溴化乙啶、溴酚蘭(上海生工公司)，DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)，PCR反應緩沖液、MgCl2、dNTP、Hotstar TaqDNA聚合酶、SNaPshot Multiplex Kit、5X Sequencing Buffer等(美國ABI公司)，PCR Marker(美國NEB公司)，HotStarTaq(德國Qiagen公司)；主要儀器包括PCR儀及自動測序儀(美國ABI 3130XL)。

1.3方法

1.3.1標本 收集所有病例并抽取外周靜脈血5 mL，采用EDTA抗凝，分離血漿，含有單個核細胞的下層成分用DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，分裝后均于-80 ℃保存。

1.3.2血漿TNF-α和IL-10濃度檢測 采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3.3SNPs檢測 采用SNaPshot SNP分析法進行分析。引物序列TNF-α-308G/A和TNF-238G/A：正向5′-TTCTGAAGCCCCTCCCAGTTCT-3′，反向5′-GTTGGGGACACACAAGCATCAA-3′；TNF-α-857C/T：正向5′-GGGGAGATGTGACCACAGCAA-3′，反向5′-ACTC CCTGGGGCCCTCTACAT-3′；TNF-α-863C/A：正向5′-GGGGAAGCAAAGGAGAAGCTGA-3′，反向5′-GC CCTCTACATGGCCCTGTCTT-3′；IL-10-819T/C和IL-10-592A/C：正向5′-TGGTGTACCCTTGTACAGGTGA TG-3′，反向5′-TTTTACTTTCCAGAGACTGGCTTCC-3′；IL-10-1082A/G：正向5′-CCGGTCCTTCCCCAGG TAGA-3′，反向5′-CCATGGAGGCTGGATAGGAGGT-3′；IL-10-3575T/A：正向5′-ATTTTGGAGCAGGGAT GGAAGA-3′，反向5′-GTGAGAAGGCAGGCACCTAT GG-3′。循環條件：95 ℃預變性2 min；94 ℃ 20 s，65～0.5 ℃循環40 s，72 ℃ 90 s，11個循環；94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，24個循環；72 ℃延伸120 s。PCR產物經純化后參照“ABI PRISM SNaPshot Multipelx”試劑盒說明進行延伸反應，延伸產物經純化后經ABI 3130XL測序儀進行測序分析。收集的原始數據用GeneMapper 4.0(美國Applied Bio systems)分析。

1.4統計學處理所有數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。Hardy-Weinberg平衡采用χ2或Fisher精確四表格檢驗；組間TNF-α和IL-10濃度比較采用方差分析和t檢驗；SNPs與DLBCL發病風險評估采用非條件邏輯回歸分析，分別對患者年齡和種族進行校正；基因型和患病狀況(有無患病)對細胞因子濃度的影響用一般線性模型分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1臨床特點DLBCL組漢族(23例)、維族(5例)、哈族(3例)，年齡32～81歲，平均55.2歲，其中男性19例，女性12例；臨床分期：Ⅰ期為2例，Ⅱ期為6例，Ⅲ期為10例，Ⅳ為20例。對照組漢族(54例)、維族(21例)、哈族(2例)，年齡20～77歲，平均43.8歲，其中男性42例，女性35例。

2.2細胞因子濃度的組間比較DLBCL組血漿IL-10水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，而DLBCL組和對照組間血漿TNF-α濃度差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 DLBCL組和健康對照組血漿TNF-α和IL-10濃度比較

2.3SNPs與DLBCL的易患性經SNaPshot SNP分析數據，結果顯示各基因多態性位點的基因型在本組人群中的分布經檢驗符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規律(P>0.05)，確認分析樣本均達到遺傳平衡的群體，具有群體代表性。在8個候選的SNPs中，TNF-α-863C/A多態性分布在DLBCL組和對照組間差異有顯著性，其中CA/AA基因型的發病風險是CC基因型的2.280倍(95%CI=1.091～4.765，P=0.028)，其余7個SNPs多態性分布在兩組間差異均無顯著性(P>0.05，表2，圖1、2)。

圖1 SNaPshot電泳峰型圖

橙色峰為SIZE STANDARD，藍色、綠色、紅色、黑色峰分別代表延伸加入ddGTP、ddATP、ddTTP和ddCTP的延伸產物，峰下面標注的為等位基因；若延伸引物是正向的，等位基因則跟延伸加入的堿基一致；若延伸引物是反向的，則跟延伸加入的堿基互補

圖2 單位點分型圖

A.單一紅色主峰，代表TT基因型，B.綠色和紅色主峰各一個，代表A/T基因型，C.單一綠色主峰，代表AA基因型

2.4基因型和患病狀況對細胞因子濃度的影響患病狀況對IL-10水平影響顯著，而對TNF-α水平影響較?。辉谂懦疾顩r對血漿TNF-α和IL-10水平的影響后，各基因多態性對其相應血漿濃度影響較小(P>0.05，表3)。

3 討論

TNF-α和IL-10是具有廣泛生物學效應的細胞因子，在淋巴細胞生長、分化和成熟中發揮重要作用[2-3]，其合成受遺傳因素(基因多態性)影響。近年TNF-α和IL-10與NHL的關系引起國內外學者們越來越多的關注，包括基因多態性與NHL或一些亞型的發病風險或預后的相關性以及血漿細胞因子水平與NHL發生、發展的關系等。實驗由于受檢測方法、地域和種族等因素的影響，分析結果尚缺乏一致性。

IL-10由正常B淋巴細胞、腫瘤性B淋巴細胞、單核巨噬細胞等多種細胞分泌[4]，能夠抑制IL-2和INF-γ的分泌及Th1細胞的活性，使腫瘤細胞逃避機體免疫殺傷，促進腫瘤細胞增殖和播散。本組發現DLBCL組血漿IL-10水平明顯增高，與對照組相比差異具有統計學意義，該結果與相關文獻報道一致[5-6]，進一步證實IL-10與DLBCL發生、發展過程相關。此外，已有報道證實IL-10高表達與DLBCL化療耐藥及不良預后有關[7-8]，對臨床具有重要指導意義。TNF-α主要由巨噬細胞和淋巴瘤細胞分泌，是調節炎癥反應和免疫功能的關鍵因子，對腫瘤細胞具有促進和抑制雙重作用[9]。本組DLBCL中TNF-α雖有增高趨勢，但與健康對照組差異無統計學意義，與國內一些文獻報道不符，如楊巍巍等[10-11]研究數據顯示DLBCL患者血漿TNF-α水平較正常人群顯著升高。國外有關血漿TNF-α水平與NHL關系方面的報道較多，但結論亦存在明顯不同。如Purdue等[6,12]的2項研究均顯示NHL患者血漿TNF-α水平顯著增高，且TNF-α高表達人群易患性風險顯著升高，兩者間呈正相關關系；Conroy等[13]報道TNF-α水平在DLBCL患者無明顯增高，兩者之間無相關性；Saberi等[14]報道則證實B細胞NHL患者血漿TNF-α水平顯著低于正常人群，且TNF-α高水平組罹患淋巴瘤的風險顯著降低，即兩者呈負相關關系。Gu等[15]通過對大樣本量人群進行血漿細胞因子水平檢測及其后NHL發病情況的隨訪發現，高水平TNF-α與NHL發病風險有關，但該相關性因隨訪時間變長會被削弱，對于抽血取樣后隨訪周期大于5年罹患NHL的病例，兩者間無統計學意義。我們認為血漿TNF-α水平與NHL(包括DLBCL)相關性受分析者樣本量大小及發病時間長短等因素影響較大，兩者之間的關系尚需進一步驗證。雖然DLBCL患者血漿中TNF-α水平未見明顯增高，但我們前期研究顯示它在DLBCL組織中呈高表達[16]，推測TNF-α主要通過自分泌和旁分泌在腫瘤局部發揮作用，包括以自分泌方式作用于腫瘤細胞自身和以旁分泌方式影響腫瘤微環境等。

表2 TNF-α和IL-10基因多態性與DLBCL發病風險的相關性

表3 TNF-α和IL-10基因SNPs對相應血漿細胞因子濃度的影響

基因變異如SNPs能夠影響NHL患病風險及預后[17-18]，且對具有惡性血液系統腫瘤家族史成員影響尤為顯著，可使其罹患NHL的風險增高2～3倍[19]，提示遺傳因素在NHL發病中起重要作用。近年，已有文獻報道TNF-α和IL-10基因變異與NHL(包括DLBCL)發病風險有關，可能的機制是這些變異影響基因的表達，進而影響人類對疾病的易感性。但也有部分報道顯示它們對NHL發病無明顯影響，可能該影響作用因不同人種而不同[20]。本實驗顯示TNF-α和IL-10的8個SNPs中，僅TNF-α-863C/A與DLBCL發病有關，其中CA/AA基因型的發病風險是CC基因型的2.280倍，而其他SNPs包括研究較多的幾個位點如TNF-α-308G/A、IL-10-1082A/G和IL-10-3575T/A與DLBCL發病均無明顯相關性。同時，本實驗發現各SNPs對其相應細胞因子血漿濃度均無明顯影響，推測DLBCL患者IL-10水平增高為復雜的細胞因子網絡相互作用及調控結果。

綜上所述，TNF-α-863C/A多態性與DLBCL易患性有關；血漿TNF-α水平在患者中無明顯增高，提示其可能主要在局部發揮作用，參與腫瘤發生、發展。IL-10在DLBCL患者血漿中顯著增高，與腫瘤發生、發展關系密切，可輔助用于病情監測和預后判斷。由于本組樣本量偏小，需加大樣本量或聯合多中心分析對實驗結果進一步論證。

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CorrelationbetweenpolymorphismsinTNF-αandIL-10genesandplasmacincentrationwithdiffuselargeB-celllymphoma

SHEN Yan1, GU Xia2, FU Ling3, ZOU Hong-yun4, SHI Yu-wei5

(1DepartmentofPathology,theFourthAffiliatedHospitalofGugangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511447,China;2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofGugangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China;3DepartmentofHematology,thePeople’sHospitaloftheXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830001,China;4ResearchLaboraryofMedicalScience,theGeneralHospitalofUrumqiMilitaryCommand,Urumqi830000,China;5DepartmentofHematology,theSecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830063,China)

PurposeTo explore the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) of TNF-αand IL-10 genes as well as their plasma levels and pathogenesis of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL).MethodsSnapshot SNP genotype technique was used to assess genetic variation in 6 SNPs for TNF-α and IL-10 in 38 DLBCL cases and 77 healthy controls, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to measure the plasma concentrations of TNF-α and IL-10 in the above population.ResultsPlasma IL-10 level in DLBCL cases was higher than that in controls (P<0.05), but there was no significant difference in plasma TNF-αlevel between the two groups (P>0.05). Of all the candidate SNPs, the geneotype distribution for TNF-α-863C/A showed significant differences between the case and control groups (P<0.05), and carriers with CA/AA genotypes had more two-fold risks of DLBCL than those with the CC genotype (95%CI=1.091-4.765,P=0.028). However several other candidate SNPs showed no significant difference in the geneotype distributions between the cases and controls (P>0.05). After excluding the effects of disease status on plasma TNF-alpha and IL-10 levels, the polymorphism of each gene had no significant effect on the corresponding plasma concentration (P>0.05).ConclusionTNF-α-863C/A polymorphism may be associated with the risk of DLBCL, and IL-10 play an important role in occurrence and development of DLBCL.

diffuse large B-cell lymphoma； TNF-α； IL-10； single nucleotide polymorphism； enzyme-linked immunosorbent assay

時間：2017-7-18 11:51 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.002.html

國家自然科學基金(30860096)

1廣州醫科大學附屬第四醫院病理科，廣州 5114472廣州醫科大學附屬第一醫院病理科，廣州 5101203新疆維吾爾自治區人民醫院血液科，烏魯木齊 8300014蘭州軍區烏魯木齊總醫院臨床醫學研究所，烏魯木齊 8300005新疆醫科大學第二附屬醫院血液科，烏魯木齊 830063

沈 艷，女，碩士，主治醫師。E-mail: alice1977@163.com 顧 霞，女，博士，教授，通訊作者。E-mail: guxia1373@sohu.com

R 733.4

:A

:1001-7399(2017)07-0715-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.002

接受日期：2017-05-03