HOTAIR-siRNA通過miR-21對肝癌侵襲、轉移的影響

王永玲，高建芝，閆姝潔，王 瓊，韋立新

HOTAIR-siRNA通過miR-21對肝癌侵襲、轉移的影響

王永玲1，高建芝2,3，閆姝潔2，王 瓊3，韋立新3

目的探討長鏈非編碼HOTAIR靶控miR-21對肝癌細胞侵襲的影響及相關機制。方法采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術檢測30例肝癌組織中miR-21的表達，及其與臨床病理特征的相關性；HOTAIR的siRNA轉染人肝癌HepG2細胞，采用Transwell小室法檢測HepG2細胞的侵襲活性；應用qRT-PCR法檢測HepG2細胞中miR-21的表達；采用Western blot法檢測MMP-2蛋白的表達，并分析其與miR-21的相關性。結果qRT-PCR檢測發現miR-21在肝癌組織中的表達水平均明顯高于癌旁組織(P<0.05)；miR-21表達與腫瘤惡性程度、分化程度及侵襲轉移均呈正相關；與患者AFP、腫瘤大小及腫瘤數目無關。沉默HOTAIR基因后，HepG2細胞侵襲能力下降，miR-21基因和MMP-2蛋白的表達均下調且兩者呈正相關。結論miR-21在肝癌組織中呈高表達，并與肝癌惡性程度、腫瘤分化、門靜脈癌栓及侵襲轉移有關；HOTAIR可能通過靶控miR-21的表達抑制肝癌細胞的侵襲與轉移。

肝腫瘤；長鏈非編碼RNA；miR-21；侵襲和轉移；MMP-2

原發性肝癌是病死率極高的惡性腫瘤之一，除早期手術切除外，采用放、化療均不能取得較好療效。目前，諸多學者從生物學角度尋找治療肝癌的靶點。研究表明，HOX轉錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)在結直腸癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤組織中的表達水平與其轉移、復發及預后呈正相關[1-4]。文獻報道，lncRNA和miRNA之間的關系密切，miRNA可通過作用于lncRNA影響腫瘤的發生、發展；lncRNA也可作為miRNA的前體，加工成miRNA后發揮作用。其中短鏈非編碼RNA-21(miR-21)位于17q23.2染色體FRA17B脆性區域，是具有自主轉錄功能的miRNA，在胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌等腫瘤中呈過表達，且與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移密切相關[5-8]。目前，關于miR-21對肝癌細胞侵襲、轉移相關信號蛋白的調節作用及其機制是否與長鏈非編碼HOTAIR的調控尚不清楚。本文應用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術檢測miR-21在肝癌中的表達及與臨床病理特征的關系，并將HepG2細胞的HOTAIR基因沉默，觀察肝癌細胞生物學行為的變化、miR-21基因和MMP-2蛋白的表達及兩者的相關性，探討HOTAIR靶控miR-21的表達對肝癌細胞侵襲、轉移相關信號蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織樣本 收集2012年9月～2013年5月解放軍301醫院手術切除的30例肝癌標本及對應癌旁組織，所有患者術前均未行放、化療，肝癌組織經病理確診為肝細胞癌；癌旁組織來源于距離腫瘤邊緣3 cm以上的未侵襲組織。所取組織標本立即于液氮中保存，提取RNA備用。所有組織標本均已獲得患者同意，并簽署知情同意書。

1.1.2細胞系 HepG2人肝癌細胞系由中國人民解放軍總醫院消化內科實驗室提供。

1.1.3主要試劑及材料 胎牛血清購自浙江天杭公司；Transwell小室購自加拿大Costar公司；轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Introgen公司；Trizol購自上海世儀公司；逆轉錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司；用Primier 5.0軟件設計各基因的引物序列，全部引物序列由北京三博遠志公司合成。兔抗鼠PTEN、MMP-2抗體及GADPH抗體均購自Sigma公司；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR檢測肝癌組織miR-21的表達及轉染后細胞miR-21的表達 按Trizol試劑盒說明書提取肝癌組織或細胞總RNA，紫外分光光度計測定其純度及濃度，取比值為1.8～2.0之間的RNA進行逆轉錄。根據TaKaRa試劑盒說明書將miR-21逆轉錄為相應的cDNA，反應溫度：42 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，置于4 ℃備用。應用qRT-PCR技術檢測miR-21在肝癌組織及癌旁組織中的表達(高表達：肝癌組織表達水平較癌旁組織高；低表達：肝癌組織表達水平較癌旁組織低)、干擾HOTAIR的HepG2中miR-21的表達。hsa-miR-21-5p的引物序列為5′-GGGGTAGCTTATCAGACTGATGTTG-3′；miRNU6-2(內參U6)的引物序列為：5′-CTGCGCAAGGATGACACGC-3′。反應條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，合計45個循環。每個實驗重復3次。采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。

1.2.2細胞培養及siRNA干擾試驗 HepG2肝癌細胞用含100 mL/L胎牛血清和雙抗的DMEM 培養基在37 ℃ 5%CO2的培養箱中培養。轉染前24 h將HepG2細胞接種于12孔板中，按Lipofectamine 2000的說明書進行操作，將Lipofectamine 2000與HOTAIR的siRNA混勻，室溫放置20 min加入培養HepG2的培養皿中繼續培養，qRT-PCR技術檢測siRNA的干擾效率。control siRNA作為對照組。

1.2.3Transwell小室法檢測細胞侵襲能力 將融化后Matrigel基質膠用DMEM培養基稀釋后加100 L于Transwell小室的上室，37 ℃培養箱中孵育5 h使Matrigel膠凝固，將干預48 h后的細胞胰酶消化，用含10 mL/L FBS DMEM培養基重懸細胞并配成每毫升105個細胞懸液，把該細胞懸液加入200 L于上室，下室加入200 mL/L FBS的DMEM培養基600 L，37 ℃ 5%CO2培養箱孵育24 h，用棉簽輕輕拭去濾膜上表面未穿過的細胞，4%多聚甲醛固定，1 g/L結晶紫染色，PBS沖洗后進行高倍顯微鏡下計算細胞數(每小室隨機取5個視野)，以計數穿膜細胞數目來間接反映腫瘤細胞侵襲能力。

1.2.4Western blot檢測細胞MMP-2的表達 移去培養液，用1 mL預冷的1×PBS沖洗細胞，移去PBS，加入裂解液4 ℃過夜；采用BCA蛋白檢測試劑盒對各組細胞蛋白進行定量。按照每孔30 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉印PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，分別加入按1 ∶2 000比例稀釋MMP-2，一抗4 ℃孵育過夜；1 ∶20 000二抗(山羊抗小鼠IgG HRP)常溫下孵育2 h行顯色、曝光、膠片掃描、定量分析。用Image J圖像分析軟件分析各條帶的灰度值，以目的蛋白對GAPDH相對值記錄結果，各標本重復3次，取平均值。

1.3統計學分析采用GraphPad Prism 5.0和SPSS 19.0軟件進行統計學處理，符合正態分布的計量資料以表示。采用χ2檢驗法評估miR-21表達水平與腫瘤的復發及臨床病理特征之間的關系，采用Spearman進行相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1miR-21的表達與肝癌臨床病理特征的相關性miR-21的高表達與肝癌惡性程度、腫瘤分化、門靜脈癌栓及侵襲轉移均相關(P<0.05)；與患者腫瘤大小、數目及腫瘤標志物AFP等均無關(P>0.05，表1)。

表1 miR-21與肝癌臨床病理特征的相關性

*P<0.05

2.3HOTAIR-siRNA干擾效果檢測及對肝癌細胞侵襲能力的影響qRT-PCR檢測結果顯示，HepG2細胞轉染HOTAIR-siRNA后，HOTAIR mRNA表達較對照組明顯下調(P<0.05)，提示轉染成功(圖1)。與對照組相比，HOTAIR-siRNA組侵襲出的細胞數明顯降低(P<0.05，圖2)。

圖1 實驗各組HOTAIR mRNA的表達水平

AB

圖2HOTAIR-siRNA對肝癌細胞侵襲能力的影響：A.對照組；B.HOTAIR-siRNA

2.4HOTAIR-siRNA轉染后可下調肝癌細胞中miR-21的表達qRT-PCR檢測結果顯示，HepG2細胞轉染HOTAIR-siRNA后，miR-21表達量明顯低于對照組(P<0.05，圖3)。

圖3 實驗各組miR-21的表達水平

2.5HOTAIR-siRNA轉染后MMP-2的表達及與miR-21的相關性Western blot結果表明，HOTAIR-siRNA組MMP-2表達量明顯低于對照組(P<0.05，圖4)。肝癌細胞中MMP-2與miR-21的表達量之間呈正相關(R2=0.83)。

圖4 實驗各組MMP-2的蛋白表達

3 討論

非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)是無編碼蛋白質，在生物體內廣泛存在，是對生命活動發揮重要調控作用的RNA。根據ncRNA大小、結構和功能的不同將其分為miRNA、Piwi相互作用RNA(piRNA)和lncRNA等類型[9]。其中lncRNA和miRNA在腫瘤發生、發展的作用是近年學者研究的熱點。lncRNA是一類轉錄本長度大于200 bp的非編碼RNA，主要通過遺傳學調控、轉錄調控、轉錄后調控等實現對基因表達的調控[10]。HOTAIR是Rinn小組于2007年發現的以反式作用調控基因表達的lncRNA。大量研究表明，HOTAIR在結腸癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達，并與腫瘤的轉移、復發及其預后密切相關。本組結果證實，肝癌組織中HOTAIR的表達明顯增高。

miR-21是內源性長度約22 nt的非編碼單鏈RNA，被視作原癌基因，其在多數腫瘤如胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌等組織中過表達，與腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移等關系密切[5-8]。本組結果顯示：miR-21在肝癌組織中呈高表達，與以往的報道一致。隨著分析的深入，發現lncRNA和miRNA之間存在相互調節，lncRNA也可以作為競爭性內源性RNA作用于miRNA，參與靶基因的表達調控，并在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。miRNA也可能通過作用于lncRNA，從而實現對lncRNA的調控，在腫瘤的發生、發展中扮演重要角色。本組結果顯示，miR-21在肝癌組織中的表達量呈正相關，并與肝癌惡性程度、腫瘤分化、門靜脈癌栓及侵襲轉移有關，提示miR-21的高表達極有可能是引起肝癌的腫瘤增長及生物學行為惡性改變的主要原因。

為了進一步確定HOTAIR在肝癌發生、發展中的作用及與對miR-21的調控有關，本實驗用siRNA沉默肝癌細胞中HOTAIR基因，應用qRT-PCR檢測肝癌組織中miR-21的表達，發現肝癌組織中miR-21表達下調。同時，Transwell實驗證實敲除HOTAIR基因后，miR-21低表達可以抑制肝癌細胞株HepG2的侵襲，進一步揭示miR-21具有促進肝癌細胞侵襲的作用。

MMP-2是基質金屬蛋白酶家族中最重要的成員，具有降解細胞外基質，促進新生血管形成，調節細胞間黏附等作用進而促進腫瘤發生侵襲和轉移[11]。通過對侵襲因子MMP-2的檢測發現：沉默HOTAIR基因后，MMP-2蛋白的表達量明顯下降，并與miR-21的表達呈正相關，提示miR-21的下調可以通過減少MMP-2蛋白的表達進而抑制肝癌細胞的侵襲轉移。

綜上所述，miR-21在肝癌中呈高表達，并與肝癌惡性程度、腫瘤分化、門靜脈癌栓及侵襲轉移有關。長鏈非編碼HOTAIR可能通過靶控miR-21的表達水平進而抑制肝癌細胞侵襲、轉移。因此，HOTAIR可能作為肝癌診斷和判斷預后的重要標志物，也為其復發轉移治療提供潛在靶點和新的治療思路。

[1] Rinn J L, Kertesz M, Wang J K,etal. Functional demarcation of activeand silent chromatin domains in human HOX loci by nonco-ding RNAs[J]. Cell, 2007,129(7):1311-1323.

[2] Kogo R, Shimamura T, Mimori K,etal. Long noncoding RNA HOTAIR regulates polycomb-dependent chromatin modification and is associated with poor prognosis in colorectal cancers[J]. Cancer Res, 2012,71(20):6320-6326.

[3] Ishibashi M, Kogo R, Shibata K,etal. Clinical significance of the expression of long non-cod ing RNA HOTAIR in primary hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep, 2013,29(3):946-952.

[4] Gupta R A, Shah N, Wang K C,etal. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis[J]. Nature, 2010,414(7291):1071-1076.

[5] Karimi K Z, Saberi S, Tsai K W,etal. MicroRNA-21: mechanisms of oncogenesis and its application in diagnosis and prognosis of gastric cancer[J]. Arch Iran Med, 2015,18(8):524-536.

[6] Xu Y Z, Xi Q H, Ge W L,etal. Identification of serum microRNA-21 as a biomarker for early detection and prognosis in human epithelial ovarian cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013,14(2):1057-1060.

[7] Zhao Y, Zhao L, Ischenko I,etal. Antisense inhibition of microRNA-21 and microRNA-221 in tumor-initiating stem-like cells modulates tumorigenesis, metastasis, and chemotherapy resistance in pancreatic cancer[J]. Target Oncol, 2015,10(4):535-548.

[8] Xu G, Zhang Y, Wei J,etal. MicroRNA-21 promotes hepatocellular carcinoma HepG2 cell proliferation through repression of mitogen-activated protein kinase-kinase 3[J]. BMC Cancer, 2013,10(13):469.

[9] Harries L W. Long non-coding RNAs and human disease[J]. Biochem Soc Trans, 2012,4(4):902-906.

[10] Taylor D H, Chu E T, Spektor R,etal. Long non-coding RNA regulation of reproduction and development[J]. Mol Reprod Dev, 2015,82(12):932-956.

[11] Jacob A, Prekeris R. The regulation of MMP targeting to invadopodia during cancer metastasis [J]. Front Cell Dev Biol, 2015,3(4):1-8.

EffectofHOTAIR-siRNAoninvasionandmetastasisofhepatocellularcarcinomabymiR-21

WANG Yong-ling1, GAO Jian-zhi2,3, YAN Shu-jie2, WANG Qiong3, WEI Li-xin3

(1BasicMedicalCollegeofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China;2DepartmentofOncology,HospitalofZhuozhouCity,Zhuozhou072750,China;3DepartmentofPathology,GeneralHospitalofthePeople’sLiberationArmy,Beijing100080,China)

PurposeTo study the role of lnc-HOTAIR and its target-controlled miR-21 on invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells (HCC) and its related mechanisms.MethodsThe expression of miR-21 in 30 cases of HCC was detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR), and correlation with clinical pathology was also analyzed. siRNA of lnc-HOTAIR was transfected to HCC HepG2 cell (HepG2), invasive activities of HepG2 was detected by Transwell, the expression of miR-21 was determined by qRT-PCR, the expression of protein MMP-2 was determined by Western blotting, and the correlation with miR-21 expression was analyzed.ResultsCompared with pericarcinous tissue, the expressions of miR-21 in tumor tissue increased apparently (P<0.05). The expressions of miR-21 correlated positively with malignancy degree, differentiation degree and invasion and metastasis respectively, and correlated negatively with tumour size, tumour number and level of AFP respectively. After silencing the HOTAIR gene, the invasive activities of HepG2 were suppressed, the expression of miR-21 gene and MMP-2 protein were down regulated, and both of them were positively correlated.ConclusionHigh expressions of miR-21 in liver cancer correlate positively with malignancy degree, differentiation degree, intrahepatic and extrahepatic metastases and portal vein tumor thrombus respectively. HOTAIR may inhibit the invasion and metastasis of HCC by controlling the expression level of miR-21.

hepatocellular neoplasm； lncRNA； miR-21； invasion and metastasis； MMP-2

時間：2017-7-18 11:51 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.003.html

全國博士后56批二等資助(20140435)、河北省保定知識產權局資助(15ZF062)

1新鄉醫學院基礎醫學院，新鄉 4530032中國人民解放軍總醫院合作醫院涿州市醫院腫瘤科，涿州 0727503中國人民解放軍總醫院病理科，北京 100080

王永玲，女，碩士，副教授。E-mail: 838387815@qq.com 高建芝，女，博士后，副主任醫師，副教授，通訊作者。 E-mail: gaoteng.bao@163.com

R 735.7

:A

:1001-7399(2017)07-0720-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.003

接受日期：2017-05-24