涎腺腺樣囊性癌中HIF-1α和BCL-2的表達及意義

鮑合剛，肖 亮，孟 剛，王岳君，王 芬，金問森

涎腺腺樣囊性癌中HIF-1α和BCL-2的表達及意義

鮑合剛1，肖 亮1，孟 剛2，王岳君3，王 芬1，金問森1

目的分析涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)中HIF-1α和BCL-2的表達水平，探討兩者之間表達的相關性及與臨床病理特征的關系。方法采用免疫組化SP法檢測56例SACC中HIF-1α和BCL-2的表達，并分析兩者的相關性。結果SACC中HIF-1α的陽性率為64.3%，其表達水平與腫瘤TNM分期及來源腺體呈明顯相關(P<0.05)。SACC中BCL-2的陽性率為98.2%，其表達水平與HIF-1α呈正相關(P<0.05)，且HIF-1α與腫瘤TNM分期之間的相關性依賴于BCL-2的強表達(P<0.05)。結論高表達的HIF-1α和BCL-2可能影響SACC的分期。

涎腺腫瘤；腺樣囊性癌；HIF-1α；BCL-2；免疫組織化學

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是發生于唾液腺的惡性腫瘤，具有生長緩慢、易復發、早期可出現遠處轉移等特點，占頭頸部惡性腫瘤的3%～5%[1]。在絕大多數的實體腫瘤內存在缺氧微環境，缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)可在缺氧狀態下穩定表達，與HIF-1β結合后，促進下游100種以上的基因轉錄，其中包括多種與糖酵解和抗凋亡等相關的基因，從而加速腫瘤組織的轉移和血管生長，并對治療產生抵抗作用[2]。有文獻報道[3-5]，在肺癌、乳腺癌和膀胱癌等多種腫瘤組織中HIF-1α有穩定表達，且其表達水平與患者的預后呈負相關。目前，HIF-1α在SACC中的表達以及與臨床病理特征的關系仍存在較大的爭議。本實驗采用免疫組化SP法檢測56例SACC中HIF-1α、BCL-2的表達，探討兩者的相關性及其意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集安徽醫科大學第一附屬醫院病理科2004～2014年存檔的SACC患者手術切除標本56例，其中男性16例，女性40例，年齡16～74歲，中位年齡48歲，其他病理特點及臨床分期詳見表1。

1.2試劑與方法免疫組化采用SP法染色，兔抗人HIF-1α單克隆抗體、兔抗人BCL-2單克隆抗體、SP試劑盒及DAB顯色試劑盒，均購自北京中杉金橋公司。實驗步驟：石蠟組織塊經4 μm厚連續切片，依次脫蠟、水化，檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)高壓5 min修復抗原，冷卻至室溫后，3%過氧化氫浸泡10 min。免疫組化操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，HIF-1α和BCL-2一抗濃度分別為1 ∶100和1 ∶200，陰性對照以PBS代替一抗。

1.3結果判定以半定量積分法進行陽性結果判斷[6]。染色強度評分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。200倍鏡下每張切片隨機取10個視野，每個視野計數100個細胞，按陽性細胞百分比計分：<10%為1分，10%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。半定量免疫反應積分(immunoreactive score, IRS)為染色強度與陽性細胞百分比的乘積：0～2分為無表達，3～4分為弱表達，6～8分為中表達，9～12分為強表達。

1.4統計學分析采用SPSS 19.0軟件進行統計學處理，HIF-1α、BCL-2表達與臨床病理特征的相關性采用非參數的Mann-WhitneyU檢驗和Kruskal-Wallis檢驗進行分析，通過線性回歸分析HIF-1α和BCL-2之間的相關性。另外，以BCL-2表達水平進行分層，采用Wilcoxon檢驗分析BCL-2的不同表達對HIF-1α與SACC臨床病理特征的相關性影響。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1組織學特征56例SACC依據腫瘤病理亞型分為：篩狀型25例(44.6%)、管狀型22例(39.3%)和實體型9例(16.1%)，發生于小腺體35例(62.5%)、大腺體21例(37.5%)，腫瘤無包膜形成，呈浸潤性生長。管狀型由內側的立方狀細胞和外側的梭形細胞構成散在或相互吻合的小管構成。實體型主要為橢圓形呈肌上皮細胞分化的腫瘤細胞圍成實性細胞巢或寬帶狀結構。篩狀型為最常見的典型結構，由形態單一的梭形細胞組成的細胞巢或條索環繞的多個假囊腔樣篩孔呈同心圓排列，似藕的斷面，篩孔大小不等，其間散在由立方狀細胞組成的小管狀結構。

圖1HIF-1α在SACC中的表達，SP法：A.弱表達(管狀型)，B.中等表達(管狀型)，C.強表達(篩狀型)圖2BCL-2在SACC中的表達，SP法： A.弱表達(實體型)，B.中等表達(管狀型)，C.強表達(管狀型)

2.2HIF-1α、BCL-2在SACC中的表達HIF-1α在SACC中的表達主要定位于胞質和胞核中，呈棕黃色或深棕色顆粒，癌旁正常的腺體組織則未被染色，陽性率為64.3%(36例)，其中HIF-1α弱表達為15例(26.8%)，中表達為9例(16.1%)，強表達為12例(21.4%)(圖1)。BCL-2在SACC中的表達主要定位于胞質和胞膜中，呈棕黃色或深棕色顆粒，癌旁正常的腺體組織則未被染色，陽性率為98.2%(55例)，其中弱表達為2例(3.6%)，中表達為9例(16.1%)，強表達為44例(78.6%)(圖2)。

2.3HIF-1α和BCL-2與SACC臨床病理特征的關系HIF-1α的表達與SACC的臨床分期(TNM分期)、來源的腺體呈顯著相關，與患者性別、年齡、神經侵犯以及腫瘤病理亞型無關(表1)。BCL-2的表達與SACC臨床病理特征無關(表1)，但與HIF-1α的表達水平存在顯著相關(圖3)。

圖3 HIF-1α和BCL-2的相關性

散點代表同一標本HIF-1α和BCL-2的IRS，兩種蛋白表達的IRS呈顯著相關(β=0.236，P<0.05)，回歸方程：Y=0.36+0.48X(r=0.33，P=0.013)

2.4BCL-2、HIF-1α表達的相關性采用Wilcoxon檢驗BCL-2表達水平分層，分析BCL-2對HIF-1α和臨床分期相關性的影響。結果顯示，在BCL-2強表達的SACC中，HIF-1α與臨床分期具有明顯相關性(Z=2.43，P<0.05)；而在非強表達BCL-2的腫瘤患者標本中，HIF-1α與臨床分期無顯著相關性(Z=0.33，P>0.05)。

表1 HIF-1α和BCL-2的表達與SACC臨床病理特征的關系[n(%)]

**P<0.01,*P<0.05

3 討論

有文獻報道[7-8]，SACC好發于女性且發病年齡跨度較大，形成神經侵犯的比例為20%～80%，發生于小腺體多見。本組收集病例符合SACC的上述特點，具有一定的代表性。

在實體腫瘤中，由于腫瘤組織的快速生長，常會在外周富血氧區域和中央壞死區之間形成O2濃度<5%的缺氧細胞層，這些細胞對放、化療具有明顯的抵抗作用，是腫瘤復發、再生長的重要來源，其中HIF-1α的穩定表達是缺氧細胞產生治療抵抗作用的重要因素之一[9]。研究表明，實體腫瘤組織中HIF-1α的表達水平與腫瘤的惡性程度、療效以及患者的預后密切相關[10]。然而，SACC中是否存在HIF-1α的穩定表達，以及與臨床病理特征間的相關性，文獻報道尚存在較大差異。早期文獻報道[11]，HIF-1α在涎腺腫瘤中表達缺失，2012年Costa等[12]在26例SACC的樣本中，發現腫瘤病理標本均表達HIF-1α，但HIF-1α的表達水平與腫瘤的范圍、轉移以及復發無關。Wang等[13]報道HIF-1α可激活內皮生長因子受體信號途徑，促進腫瘤新生血管的產生，進而導致SACC的增殖與生長。本組64.3%的病例表達HIF-1α，且HIF-1α的表達水平與臨床分期密切相關，提示SACC中HIF-1α的表達具有一定的普遍性，同時，由于臨床分期與腫瘤患者的預后緊密相關[14]，HIF-1α的表達水平可能會影響患者的預后，這也與Chen等[15]的報道結果一致。值得注意的是，本組來源于小腺體的SACC具有更高的HIF-1α表達水平。Ko等[16-17]發現，發生于小腺體的SACC患者往往預后較差且復發率較高，本組結果則部分解釋該現象的發生機制。目前關于小唾液腺來源的腫瘤組織中HIF-1α 表達變化的分子機制，需要進一步分析。

BCL-2是著名的抗凋亡蛋白，在腫瘤放射生物學領域中，BCL-2蛋白高表達可導致腫瘤對放療產生抵抗作用[18]，并且在缺氧狀態下HIF-1α可調節BCL-2的表達[19]。Al-Rawi等[20]報道在幾乎所有的涎腺惡性腫瘤中均存在BCL-2高表達，其中以SACC中BCL-2表達水平最高。本組98.2%的病例中存在BCL-2表達，其中BCL-2強表達的樣本為78.6%，其表達水平與HIF-1α呈正相關，該相關性在其他實體腫瘤組織中也曾有過報道，如腎細胞瘤、嗅神經母細胞瘤等[6,21]。體外實驗結果顯示，下調HIF-1α表達水平可降低BCL-2蛋白水平， HIF-1α表達升高則促進BCL-2蛋白的累積[22]。本組進一步分析顯示，HIF-1α對SACC臨床分期的影響依賴于BCL-2的表達水平，僅在強表達BCL-2的腫瘤中，HIF-1α的表達對臨床分期產生影響；反之HIF-1α的表達水平與臨床分期則不具有相關性，提示通過HIF-1α介導的BCL-2高表達，可能導致SACC的預后較差，也部分解釋該腫瘤具有放療抵抗性且復發率較高的原因[23]。

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ExpressionofHIF-1αandBCL-2insalivaryadenoidcysticcarcinomaanditsclinicalsignificance

BAO He-gang1, XIAO Liang1, MENG Gang2, WANG Yue-jun3, WANG Feng1, JIN Wen-sen1

(1Teaching&ResearchSectionofNuclearMedicine,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China;3DepartmentofPathology,theFourthAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

PurposeTo investigate the relationship of HIF-1α, BCL-2 and clinicopathological features in salivary adenoid cystic carcinoma by detecting the levels of two proteins.MethodsImmunohistochemical of SP staining assay was used

to detect the level of HIF-1α and BCL-2 expression in fifty-six section from primary resection of salivary adenoid cystic carcinoma. Furthermore, the correlation between the expressions of two proteins with clinical data was evaluated through differently statistical analysis.ResultsThirty-six samples (64.3%) were found to express HIF-1α. The level of HIF-1α was significantly correlated with TNM stage of tumors and the primary site of salivary adenoid cystic carcinoma (P<0.05). Positive BCL-2 expression was detected in fifty-five cases (98.2%). The level of HIF-1α was positively correlated with that of BCL-2 (P<0.05) and the significant correlation between HIF-1α and TNM stage was dependent upon the strong expression of BCL-2 (P<0.05).ConclusionIt is therefore indicated that the expression of HIF-1α and BCL-2 may influence the clinical stage of salivary adenoid cystic carcinoma.

salivary neoplasm； adenoid cystic carcinoma； HIF-1α； BCL-2； immunohistochemistry

時間：2017-7-18 11:51 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.005.html

國家自然科學基金(U1432124)

1安徽醫科大學核醫學教研室，合肥 2300322安徽醫科大學第一附屬醫院病理科，合肥 2300223安徽醫科大學第四附屬醫院病理科，合肥 230001

鮑合剛，男，碩士研究生。E-mail: 281611117@qq.com 金問森，男，碩士生導師，教授，通訊作者。E-mail: wensenjn@126.com

R 739.8

:A

:1001-7399(2017)07-0728-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.005

接受日期：2017-05-23