自噬基因LC3在子宮內膜異位癥中的表達及其意義

章龍玉，魏兆蓮，徐福霞

自噬基因LC3在子宮內膜異位癥中的表達及其意義

章龍玉1，魏兆蓮2，徐福霞1

目的探討細胞自噬狀態與子宮內膜異位癥之間的關系及其意義。方法對子宮內膜異位癥患者在位及異位內膜基質細胞(n=31)及正常子宮內膜基質細胞(n=31)行原代培養，進行免疫細胞化學鑒定；應用透射電鏡觀察組織中細胞自噬泡超微結構變化；采用RT-PCR、Western blot法檢測LC3 mRNA和蛋白的表達。結果透射電鏡結果顯示：子宮內膜在位及異位內膜細胞的自噬泡數目較少。RT-PCR及Western blot法結果顯示：子宮內膜異位癥患者在位及異位內膜的LC3 mRNA及蛋白的表達水平明顯低于正常子宮內膜(P<0.05)。子宮內膜異位癥患者在位與異位內膜的LC3 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)，而異位內膜的LC3蛋白表達水平高于在位內膜(P<0.05)。結論子宮內膜異位癥患者的在位及異位內膜基質細胞的自噬活性降低，自噬可能參與子宮內膜異位癥的發生。

細胞自噬；子宮內膜異位癥；LC3

子宮內膜基質和腺體出現在子宮體以外的部位稱為子宮內膜異位癥(endometriosis, EMT)，由具有生長功能的異位內膜所致。因EMT導致的痛經、不孕等嚴重影響育齡婦女的健康，其發病機制尚不明確。EMT與腫瘤疾病有許多共性，如轉移、種植、復發等。已明確細胞自噬的活性在多種腫瘤疾病中有所改變[1-2]。細胞自噬的形成與多種自噬因子有關，LC3是重要的細胞自噬因子[3]。目前，國內外對EMT在位及異位內膜細胞的自噬泡超微結構及LC3與EMT的相關性報道較少。本文著重探討細胞自噬狀態與EMT之間的關系及其意義，提高人們對其的認識水平。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集安徽醫科大學第一附屬醫院婦科EMT合并單側或雙側巧克力囊腫并行巧囊剝除術的患者31例，平均年齡(32.48±4.36)歲。術前用一次性內膜吸引器吸取少量子宮內膜，術后立即分離巧囊囊壁，30 min內進行分離培養操作。另收集因輸卵管不通不孕或正常女性患者合計31例正常子宮內膜，患者平均年齡(32.39±2.64)歲。女性行輸卵管通液術或造影術前用一次性內膜吸引器吸取少量子宮內膜，處理方法同上。所有患者均在月經干凈后3～7天進行手術，選取增生期的子宮內膜，由病理醫師診斷確診。所有患者月經正常，均無內科合并癥，術前6個月內未行激素類藥物治療，所有患者在采集標本前均被告知，并簽署知情同意書。

1.2主要試劑膠原酶Ⅰ購自美國Sigma公司；vimentin抗體購自上海科敏公司；CK抗體購自北京博奧森公司；逆轉錄試劑盒為美國Promega公司產品；LC3抗體(SC-271625)購自美國Santa Cruz公司；SP試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.3方法

1.3.1子宮內膜基質細胞的原代分離培養及免疫細胞化學鑒定 將選取好的子宮內膜組織及異位內膜組織用D-hanks反復沖洗后，剪碎組織至大小1 mm3。根據文獻[4]提供的方法分離EMT在位子宮內膜及異位子宮內膜基質細胞，進行原代細胞培養。采用免疫細胞化學SP法鑒定培養獲得的子宮內膜基質細胞，對于一抗的稀釋，進行預試驗后采用Anti-vimentin：1 ∶200、Anti-CK19：1 ∶200。次日室溫條件下添加二抗(生物素標記小鼠抗人IgG)，DBA顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封固，于80 ℃烤箱烤干。分離純化的子宮內膜基質細胞以備后用。

1.3.2透射電鏡樣品制備 將剛離體的組織切割至1 mm3大小，經2.5%戊二醛固定，脫水，包埋，固化，超薄切片，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察拍片。

1.3.3RT-PCR檢測LC3 mRNA的表達水平 采用Trizol提取液抽提細胞中的RNA，采用逆轉錄試劑盒將總RNA中的信使RNA(mRNA)反轉錄為cDNA，取cDNA標本按下列比例配置PCR反應體系：2×Goldstar混合物10 μL；上游引物：0.4 μL(10 μmol/L)；下游引物：0.4 uL(10 μmol/L)；模板DNA 2 μL；無RNA酶水7.2 μL。按照下列程序進行PCR反應：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，重復40個循環。得到擴增曲線后讀取Ct值，計算mRNA含量。引物如下：GAPDH上游5′-GCCGCAT CTTCTTTTGCGTC-3′，下游5′-TACGACCAAATCCGT TGACTCC-3′；LC3上游5′-TCAGACCGGCCTTTCAA GCA-3′，下游 5′-CTCGATGATCACCGGGATTTTG-3′；以GAPDH作為內參。

1.3.4Western blot檢測LC3蛋白的表達水平 將原代培養的細胞懸液1 000 r/min×5 min，加入含有1 μmol/L PMSF的RIPA細胞裂解液，進行12 000 r/ min×5 min。細胞總蛋白于上清液內。取上清，蛋白定量后分裝，-80 ℃凍存備用。SDS-PAGE電泳：SDS-PAGE凝膠配制、樣品處理、上樣與電泳、轉膜、封閉、一抗、二抗孵育。具體操作步驟按試劑盒說明書進行，使用ECL發光試劑盒檢測蛋白表達。

2 結果

2.1子宮內膜基質細胞原代培養子宮內膜基質細胞(圖1)及異位內膜基質細胞按照上述的分離純化方法，置于顯微鏡下觀察并攝片。可見鏡下細胞排列不規則，呈中間粗大、兩邊細小的紡錘體，排列無規則，生長狀態良好。

2.2子宮內膜基質細胞免疫細胞化學的鑒定子宮內膜基質細胞鏡下大部分呈紡錘體，少部分呈三角形，細胞邊緣不清晰，排列無規則。子宮內膜基質細胞CK19呈陰性(圖2A)，vimentin呈陽性(圖2B)，其細胞質呈棕黃色顆粒。隨機取5個視野(×100)，vimentin著色細胞即基質細胞比例為95%以上。

2.3正常子宮內膜組織和EMT在位及異位內膜組織中細胞自噬泡超微結構的變化正常子宮內膜組織獲得5例切片，EMT在位及異位內膜組分別獲得5例切片。結果顯示：EMT在位及異位內膜中自噬溶酶體的數量無明顯差別，其自噬溶酶體的數量明顯少于正常子宮內膜組織。自噬體表現為胞質內游離的單層或雙層膜結構包繞胞質或損傷細胞器形成的囊泡狀結構(圖3)。

2.4LC3mRNA在正常子宮內膜基質細胞和EMT在位、異位內膜基質細胞中的表達運用RT-PCR檢測LC3 mRNA在EMT在位及異位內膜組與正常子宮內膜組的表達。結果顯示：LC3 mRNA在EMT在位及異位內膜基質細胞中表達均低于正常子宮內膜組(F=4.438，P=0.015)。EMT在位子宮內膜基質細胞的LC3 mRNA與正常子宮內膜組相比其表達下調(0.435±0.227，P=0.013)，EMT異位子宮內膜基質細胞的LC3 mRNA表達量與正常子宮內膜組相比其表達也下調(0.429±0.303，P=0.011)，但EMT在位及異位內膜基質細胞的LC3 mRNA表達量差異無顯著性(1.282±0.534，P=0.949)。提示EMT不管在位及異位內膜基質細胞的LC3 mRNA表達水平均明顯低于正常子宮內膜組(圖4)。

2.5LC3蛋白在正常子宮內膜基質細胞和EMT在位、異位內膜基質細胞中的表達運用Western blot法檢測LC3蛋白在EMT在位及異位內膜組與正常子宮內膜組中的表達。結果顯示：LC3蛋白在EMT在位及異位內膜的基質細胞中表達均低于正常子宮內膜組(P=0.000)。EMT在位子宮內膜基質細胞的LC3蛋白與正常子宮內膜組相比其表達下調(0.242±0.08，0.440±0.08；P=0.000)。EMT異位子宮內膜基質細胞中LC3蛋白表達量比正常子宮內膜組相比其表達也下調(0.309±0.09，P=0.000)；EMT異位內膜基質細胞中LC3蛋白表達量明顯高于在位內膜組(P=0.003)，與RT-PCR的實驗結果基本相符(圖5)。

①②A②B③A③B③C

圖1正常子宮內膜基質細胞圖2子宮內膜基質細胞，SP法：A.CK19呈陰性；B.vimentin呈陽性圖3A.正常子宮內膜細胞自噬泡超微結構；B.EMT中在位內膜細胞自噬泡超微結構；C. EMT中異位內膜細胞自噬泡超微結構

圖4 EMT在位及異位內膜基質細胞及正常子宮內膜基質細胞中LC3 mRNA的相對表達量

3 討論

育齡期婦女發生EMT較為常見，其屬于良性疾病，但生物學行為與惡性腫瘤有相似之處，如種植、轉移、復發等。目前，EMT的發病機制存在多種學說，以經血逆流和內膜種植學說最為經典，但該學說無法解釋部分經血逆流婦女為何未患EMT。研究表明[5]：肉眼觀察EMT患者的在位子宮內膜與非EMT婦女的子宮內膜無明顯差異，但在超微結構、免疫特性和分子活性等方面可能差異有顯著性。EMT患者的在位子宮內膜的某些特性如黏附性、侵襲性、刺激形成血管的能力均較強，更易于異地生長種植。近年郎景和院士提出“在位內膜決定論”[6]，認為在位子宮內膜的生物學異常是決定因素，周圍微環境則是EMT發生的影響因素。

圖5 EMT在位、異位內膜組及正常子宮內膜組中LC3 蛋白的相對表達量

自噬是指在真核細胞中，細胞內自我清除周轉的現象，維持細胞內蛋白質平衡及內環境的穩定。自噬參與多種病理過程，可能與心肌缺血再灌注、神經退行性疾病、肥胖癥、腎臟疾病等多種疾病的發生、發展有關。自噬與腫瘤的相關性分析是近年分析地熱點。環境因素可影響自噬活性，同時諸多的信號通路也對自噬進行調控，如依賴mTOR信號通路、PI3K-AKT信號通路、磷酸腺苷激活的蛋白激酶信號通路以及非依賴mTOR的信號通路等。自噬水平能夠被一些癌基因抑制，如AKT1、PI3K、BCL-2家族中的抗凋亡蛋白；同時自噬又能夠被多種抑癌基因激活，如LKB1/STK11、DAPK1、PTEN等。

LC3是細胞自噬的標志性蛋白，定位于前自噬泡及自噬泡表面，是自噬泡膜的標志物。LC3即為ATG8，而ATG8同系物是C末端的延伸形式，經ATG4半胱氨酸蛋白酶降解后導致C-末端甘氨酸可以綴合到磷脂酰乙醇胺上。ATG8與磷脂酰乙醇胺的共價結合導致LC3-II結合到自噬體膜上，有利于自噬體的伸展。在酵母中只存在單一的ATG8蛋白，但哺乳動物至少有7個ATG8家族成員，如LC3A-C中存在LC3A的2種異構體即GABARAP和GABARAPL1-2[3]。LC3和GABARAP亞家族成員均可結合至自噬體膜上[7-8]，基因敲除的研究表明，這兩個亞族有獨特的作用且均為自噬體形成所必需。LC3的同系物可結合于自噬體膜的內表面及外表面，外表面的部分被ATG4清除，而內表面的部分不會被清除而是與貨物一起降解。LC3/GABARAP蛋白質可以招募各種蛋白質。

自噬對腫瘤的影響亦有不同。自噬活性的提高可能參與人肝癌細胞的發展，自噬蛋白LC3B的表達可能是肝細胞癌進展和預后不良的潛在標志物[9]。LC3的表達可促進乳腺癌的臨床侵襲性行為，如淋巴結及淋巴管轉移率增高和高的病理分期，抑制自噬可部分逆轉乳腺癌MCF-7/ADM細胞耐藥[10]。由于EMT與腫瘤有相似的生物學行為，故近年來關于自噬與EMT的報道愈加增多。Ruiz等[11]在EMT的小鼠模型中，應用細胞自噬抑制劑羥氯喹可以減弱人類子宮內膜細胞和內膜T-HESC細胞的體外生存能力，同時羥氯喹可以減少內膜異位病灶的數目和破壞病灶的組織病理學，升高腹腔內巨噬細胞和干擾素γ誘導蛋白趨化因子的水平，EMT誘導的小鼠子宮角中LC3B蛋白表達呈遞增趨勢，從而證明自噬在EMT的在位及異位內膜中表達失衡。Allavena等[12]證實自噬相關基因ATG14、BECN1、ATG7和LC3B的mRNA在卵巢EMT患者的異位內膜組織中的表達水平增高，子宮內膜異位細胞對凋亡和持續氧化應激的易感性降低可能有利于自噬。國內有學者報道：LC3 mRNA在異位內膜組織中的表達低于正常內膜組織；異位內膜組織與在位內膜組織相比，其表達明顯下調，但在位內膜組與正常內膜組間表達無明顯差異[13]。本實驗在EMT內膜細胞的超微結構水平發現，其在位及異位內膜細胞的自噬活性減弱，同時在位及異位內膜細胞的LC3 mRNA及蛋白表達水平降低，與報道不完全一致，可能由于上述實驗用的是內膜組織，而本實驗應用的是子宮內膜基質細胞，因而本實驗的結果更加準確。抑制哺乳動物mTOR蛋白可以增加卵巢子宮內膜異位囊腫異位內膜的自噬活性，哺乳動物mTOR靶蛋白異常活性導致子宮內膜細胞自噬的改變，這與異常凋亡相關[14]。在體外培養的EMT細胞系，苗勒管抑制物可以抑制細胞的增殖，誘導自噬與凋亡的發生[15]。

本實驗采用細胞原代培養、免疫細胞化學、透射電鏡、RT-PCR、Western blot等技術系統的分析細胞自噬與EMT的相關性。本實驗中的子宮內膜基質細胞經原代細胞培養，并鑒定。透射電鏡下觀察超薄切片，與正常子宮內膜組織相比，EMT在位及異位內膜細胞中較少出現自噬體，提示EMT組織中的細胞自噬活動較少。EMT在位及異位子宮內膜基質細胞中LC3蛋白表達水平均明顯低于正常子宮內膜組織，與RT-PCR的實驗結果相符。綜上所述，自噬可能參與子宮內膜異位癥的發生，但其確切的機制有待深入探討。

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ExpressionandclinicalsignificanceofautophagygeneLC3inendometriosis

ZHANG Long-yu1, WEI Zhao-lian2, XU Fu-xia1

(1DepartmentofObstetricsandGynecology,AnhuiNo.2ProvincePeople’sHospital,Hefei230011,China;2ReproductiveofCenter,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

PurposeTo study the relationship between autophagy and endometriosis, and its significance.MethodsThe eutopic and ectopic endometrial stromal cells from patients with endometriosis (n=31) and normal endometrial stromal cells (n=31) were cultured primarily and identified by immunocytochemistry. The ultrastructural changes of autophagic vacuoles were observed by transmission electron microscopy (TEM). RT-PCR and Western blot methods were used to detect LC3 mRNA and protein expression in endometrial cells of endometriosis patients.ResultsTEM analysis showed the number of autophagic vacuoles of eutopic and ectopic endometrial cells was fewer. RT-PCR and Western blot analysis showed that the expression of LC3 mRNA and protein in eutopic and ectopic endometrium of patients with endometriosis was significantly lower than that of the normal endometrial stromal cells (P<0.05). There was no significant difference in the expression of LC3 mRNA between eutopic and ectopic endometrium of patients with endometriosis (P>0.05), but the expression of LC3 protein in ectopic endometrium was higher than that in eutopic endometrium of patients with endometriosis (P<0.05).ConclusionAutophagy activity is downregulated in eutopic and ectopic endometrial stromal cells with endometrosis. Autophagy may be involved in the pathogenesis of endometriosis.

autophagy； endometriosis； LC3

時間：2017-7-18 11:51 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.006.html

1安徽省第二人民醫院婦產科，合肥 2300112安徽醫科大學第一附屬醫院生殖中心，合肥 230032

章龍玉，女，碩士，醫師。E-mail: zhanglongyu8@126.com 魏兆蓮，女，博士，教授，博士生導師，主任醫師，通訊作者。E-mail: weizhaolian_1@126.com

R 711

:A

:1001-7399(2017)07-0732-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.006

接受日期：2017-05-20