長鏈非編碼RNA-HOTAIR對子宮內膜癌轉移侵襲能力的影響

王明娟，周曉慧，劉 超

長鏈非編碼RNA-HOTAIR對子宮內膜癌轉移侵襲能力的影響

王明娟1，周曉慧2，劉 超3

目的探討長鏈非編碼RNA(lncRNA)-HOTAIR對子宮內膜癌細胞增殖和侵襲轉移等生物學行為調控作用的影響。方法收集子宮內膜癌組織標本20例、增生子宮內膜組織標本20例、正常子宮內膜組織標本10例，采用RT-PCR檢測lncRNA-HOTAIR在正常子宮內膜組織、增生子宮內膜組織及各期子宮內膜癌組織中的差異表達；利用脂質體Lipofectamine 2000將HOTAIR-siRNA轉染Ishikawa細胞；分別采用MTT實驗檢測各組細胞增殖能力、Transwell小室實驗對各組細胞遷移和侵襲能力進行檢測。結果與正常子宮內膜組相比，lncRNA-HOTAIR在各期子宮內膜癌組的基因表達水平顯著升高(P<0.05)；lncRNA-HOTAIR在單純性增生子宮內膜組、不典型性增生子宮內膜組的表達水平，差異無顯著性(P>0.05)。HOTAIR-siRNA靶向抑制組的細胞增殖水平、侵襲能力與遷移能力顯著低于空白對照組與陰性對照組(P<0.05)。結論lncRNA-HOTAIR參與子宮內膜癌的發生、發展，可能在子宮內膜癌的轉移侵襲中起重要作用。

子宮腫瘤；子宮內膜癌；lncRNA-HOTAIR；siRNA；遷移與侵襲

子宮內膜癌是女性最常見的生殖系統惡性腫瘤，近年在全球范圍內發病率呈上升趨勢[1-3]，嚴重威脅婦女生命和健康。15%～25%的子宮內膜癌患者就診時已經為晚期，大多數子宮內膜癌患者預后較差[4]，患者的子宮外轉移與其預后明顯相關，子宮內膜癌的發生、發展和轉歸是一個極其復雜的多階段、多基因調控異常的過程[5]，是癌基因激活與抑癌基因失活共同作用的結果。長鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達紊亂參與多種疾病的發生、發展，尤其在腫瘤的發生中起重要作用[6]。HOTAIR是個已知的通過反式作用調節基因表達的lncRNA，長度為2 158 bp，目前HOTAIR在乳腺癌、食管癌、肝癌等多種腫瘤的研究中取得一定進展，并且與腫瘤的轉移及預后密切相關[7]。本實驗采用RT-PCR、MTT、Transwell小室法旨在探討HOTAIR與子宮內膜癌細胞增殖和轉移侵襲的相關性，對HOTAIR在子宮內膜癌中的作用進行初步分析，為子宮內膜癌的治療及預后評價提供實驗依據[8]。

1 材料與方法

1.1材料收集承德醫學院附屬醫院婦科2013年1月～2014年12月子宮組織50例，分別為正常子宮內膜組織10例、單純性增生子宮內膜組織10例、不典型增生子宮內膜組織10例及各期子宮內膜癌組織20例(其中子宮內膜癌Ⅰ期10例、子宮內膜癌Ⅱ期5例、子宮內膜癌Ⅲ期5例)。患者均簽署知情同意書，子宮內膜癌患者術前均未接受放、化療或性激素治療，所有病例均無其他惡性腫瘤。將新鮮組織于組織離體后30 min內取材，置于經RNA酶滅活的無菌凍存管中，液氮速凍4 h，-80 ℃冰箱儲存備用。

1.2試劑人子宮內膜癌細胞株Ishikawa購于凱基生物公司，RT-PCR引物由上海生物公司合成；RNA提取試劑盒購自Omega公司；轉染試劑脂質體Lipofectamine 2000、Trizol均購自 Invitrogen公司；反轉錄試劑盒和PCR試劑盒，購自大連寶生物公司；DMEM培養基購自Gibco公司；MTT購自Sigma公司；Transwell小室購自Corning公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養 人子宮內膜癌Ishikawa細胞培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃ 5% CO2，飽和濕度的培養箱中培養。

1.3.2總RNA提取及RT-PCR檢測 采用Trizol法提取RNA，提取細胞中的RNA時，細胞(1～5)×107個加入1 mL Trizol。提取組織樣本RNA時，取-80 ℃保存的新鮮組織100 mg，研磨后加入1 mL Trizol，再次研磨混勻后提取RNA，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。用核酸定量儀測定其純度和濃度，根據反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄合成cDNA，以cDNA作為模板進行PCR特異性擴增，檢測lncRNA-HOTAIR和內參GAPDH的基因表達。HOTAIR引物序列：上游5′-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3′，下游5′-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GAATGGGCAGCCGTTAGGAA-3′，下游5′-GGTCATTGATGGCAACAATAT-3′。反應條件為預變性：94 ℃ 2 min，變性：94 ℃ 30 s，退火：62 ℃ 30 s，延伸：72 ℃ 20 s，延伸：10 ℃ 10 min，30個循環。應用Quantity One軟件進行定量分析，以目的條帶光密度與GAPDH條帶光密度的比值，作為各目的基因表達的相對水平。

1.3.3特異干擾RNA(siRNA)抑制lncRNA-HOTAIR的表達 應用HOTAIR特異性siRNA(上海吉瑪公司設計合成)的序列信息如下。siRNA1：正義5′-GCACAGAGCAACUCUAUAATT-3′，反義5′-UUAU AGAGUUGCUCUGUGCTT-3′；siRNA2：正義5′-GAGG CGCUAAUUAAUUGAUTT-3，反義5′-AUCAAUUAAU UAGCGCCUCTT-3′；siRNA3：正義5′-GCUAAGGA AAGAUCCAAAUTT-3′，反義5′-AUUUGGAUCUUUC CUUAGCTT-3′；陰性對照：正義5′-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3′，反義5′-ACGUGACACGUUCGG AGAATT-3′。利用Lipofectamine 2000將siRNA轉染至Ishikawa細胞，細胞密度每毫升1×105個。(1)設空白對照組：子宮內膜癌細胞Ishikawa；(2)陰性對照組：在Ishikawa細胞中轉染空白序列；(3)實驗組：在Ishikawa細胞中轉染特異HOTAIR-siRNA序列siRNA1、siRNA2、siRNA3的終濃度50 nmol/L，轉染48 h后采用RT-PCR檢測siRNA對HOTAIR的抑制率。

1.3.4MTT法檢測細胞的增殖水平 分別取200 μL的空白對照組、陰性對照組、實驗組中HOTAIR-siRNA3細胞，接種至96孔培養板中，每組設置3個復孔。48 h終止培養，終止培養前4 h每孔需加入20 μL MTT,使其終濃度為5 mg/mL。培養完畢后吸除孔內液體，并加入200 μL DMSO。用酶標儀測定在570、630 nm波長下的光密度值(OD)，其中以OD630作校準；細胞活力用OD570表示。每組實驗重復3次，取平均值。

1.3.5細胞體外遷移和侵襲實驗 侵襲實驗：用無血清DMEM培養基稀釋Matrigel，每孔使用100 mL Matrigel包被Transwell小室。分別取空白對照組、陰性對照組、HOTAIR-siRNA3組各200 μL細胞懸液(含1%胎牛血清 DMEM)加入Transwell小室的上室中(細胞密度為每毫升1×105個)，將含20%胎牛血清DMEM培養液500 μL加入下室中，每組設3個復孔，實驗重復3次。將Transwell小室板轉移至37 ℃ 5%CO2的培養箱中培養36 h。取出Transwell小室，用干凈的棉簽擦去上室表面的細胞及Matrigel，PBS沖洗2次，用甲醇固定30 min，然后用0.1%結晶紫染色30 min，純水清洗，顯微鏡下計數至少5個高倍視野穿膜的細胞，計算每個視野平均穿膜細胞數，作為評價細胞侵襲能力的指標。遷移實驗：除不在Transwell小室中包被Matrigel，其余步驟同侵襲實驗。

2 結果

2.1HOTAIR在正常、增生子宮內膜和子宮內膜癌組織中的表達與正常子宮內膜組相比，單純性子宮內膜增生組、不典型子宮內膜增生組中HOTAIR基因的表達水平，差異均無顯著性(P>0.05)。與正常子宮內膜組相比，子宮內膜癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中HOTAIR基因的表達水平均顯著升高(P<0.05)，提示HOTAIR的高表達與子宮內膜癌的發生、發展有關(圖1)。

圖1 HOTAIR在正常、增生子宮內膜及子宮內膜癌組織中的表達

1.Marker；2.正常子宮內膜；3.單純性子宮內膜增生；4.不典型子宮內膜增生；5.子宮內膜癌Ⅰ期；6.子宮內膜癌Ⅱ期；7.子宮內膜癌Ⅲ期

2.2特異siRNA抑制lncRNA-HOTAIR的表達分別收集空白細胞、陰性對照、HOTAIR-siRNA1、HOTAIR-siRNA2、HOTAIR-siRNA3各組細胞，提取總RNA。采用RT-PCR法檢測特異siRNA對HOTAIR基因表達的抑制率。結果顯示：與空白細胞組比較，陰性對照組HOTAIR基因的表達水平差異無顯著性(P>0.05)；與陰性對照組比較，HOTAIR-siRNA1、HOTAIR-siRNA2、HOTAIR-siRNA3組中HOTAIR基因的表達水平均顯著降低(P<0.05)；通過比較3組中HOTAIR基因的表達水平發現，HOTAIR-siRNA1組與HOTAIR-siRNA2組基因的表達水平差異無顯著性(P>0.05)；與HOTAIR-siRNA1組相比，HOTAIR-siRNA3組基因的表達水平顯著降低(P<0.05)；與HOTAIR-siRNA2組相比，HOTAIR-siRNA3組基因的表達水平顯著降低(P<0.05)，提示HOTAIR-siRNA3干擾性最強，本組將其作為后續實驗的干擾條件(圖2)。

1.Marker；2.HOTAIR-siRNA1；3.HOTAIR-siRNA2；4.HOTAIR-siRNA3；5.陰性對照；6.空白對照

2.3MTT法檢測各組細胞增殖水平MTT實驗結果顯示：與空白對照組比較，陰性對照組細胞的增殖能力無明顯改變(P>0.05)；與陰性對照組比較，HOTAIR-siRNA3組細胞的增殖能力顯著減弱(P<0.05，圖3)。

2.4Transwell小室實驗檢測細胞侵襲和遷移能力

2.4.1細胞侵襲實驗 與空白對照組比較，陰性對照組穿膜細胞數差異無顯著性(P>0.05)；與陰性對照組比較，HOTAIR-siRNA3組穿膜細胞數顯著減少(P<0.01，圖4、5)。

2.4.2細胞遷移實驗 與空白對照組比較，陰性對照組穿膜細胞數無明顯差異(P>0.05)；與陰性對照組比較，HOTAIR-siRNA3組穿膜細胞數顯著減少(P<0.01，圖6、7)。

圖3 比較各組細胞增殖水平與陰性對照組比較，*P<0.05

ABC圖4 細胞侵襲實驗:A.空白對照組;B.陰性對照組;C.HO-TAIR-siRNA3組

圖5 HOTAIR-siRNA對子宮內膜癌細胞侵襲能力的影響與陰性對照組比較，*P<0.01

圖6細胞遷移實驗：A.空白對照組；B.陰性對照組；C.HOTAIR-siRNA3組

圖7 HOTAIR-siRNA對子宮內膜癌細胞遷移能力的影響與陰性對照組比較，*P<0.01

3 討論

子宮內膜癌是婦科腫瘤最常見的惡性腫瘤，位居女性生殖道惡性腫瘤的首位，主要原因可能是高級別腫瘤(如漿液性腺癌)、晚期和老年患者的增長[9]。由于大多數子宮內膜癌具有基因突變，因此從分子層面上探索子宮內膜癌的發病機制及與子宮內膜癌轉移侵襲的分子機制，將為子宮內膜癌的預后評估和基因治療尋找新的靶點。

lncRNA是長度大于200 nt的RNA，其本身不具有編碼蛋白的功能，以RNA的形式從多種層面上調控基因的表達。lncRNA可通過RNA與蛋白質的相互作用、RNA與DNA、RNA與RNA的相互作用方式，從表觀遺傳修飾、轉錄及轉錄后等多個層面調控基因表達[10]。

近年關于lncRNA功能的研究進展迅速，但絕大部分lncRNA的功能尚未明確[11]。只有少部分 lncRNA的生物學功能得到驗證，盡管文獻報道較少，但lncRNA在惡性腫瘤等人類疾病的治療和診斷中具有重要的潛在應用前景。

lncRNA-HOTAIR位于人類12號染色體HOHC基因座，屬于典型的反義lncRNA，主要通過反式作用沉默染色質。大量研究證實，HOTAIR在乳腺癌、食管癌、肝癌等多種實體瘤中均高表達，且與腫瘤細胞的侵襲轉移、腫瘤復發、不良預后等均密切相關[7]。Gucta等[12]證實HOTAIR在原發性與轉移性乳腺癌組織中均顯著表達，且在轉移灶中HOTAIR表達水平高出正常上皮組織200～2 000倍，進一步分析發現，雌二醇可誘導HOTAIR的轉錄，提示HOTAIR轉錄啟動子區域存在雌二醇的功能反應元件。體外實驗證實，HOTAIR在食管鱗癌細胞系中KYSE30細胞株的表達水平較高，采用siRNA技術敲低HOTAIR，可顯著降低KYSE30細胞轉移和侵襲能力，并顯著增加細胞凋亡率。HOTAIR已被發現[13]在多種腫瘤細胞中調節VEGF、MMP-9蛋白及EMT相關基因，增強腫瘤生物學行為，促進腫瘤轉移， HOTAIR缺失可減緩細胞增殖，降低MMP及VEGF蛋白表達。本組探討正常子宮內膜、增生子宮內膜及子宮內膜癌組織中HOTAIR的表達，結果顯示：與正常子宮內膜組比較，單純性子宮內膜增生組、不典型子宮內膜增生組中HOTAIR基因的表達水平差異均無顯著性(P>0.05)；與正常子宮內膜組比較，子宮內膜癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中HOTAIR基因的表達水平均顯著升高(P<0.05)，表明lncRNA-HOTAIR的表達水平與子宮內膜癌的發生、發展密切相關。

本實驗通過特異siRNA靶向抑制子宮內膜癌細胞HOTAIR的表達，采用MTT細胞增殖實驗、Transwell小室實驗，分析子宮內膜癌細胞中HOTAIR的表達水平與子宮內膜癌轉移侵襲的相關性。結果顯示：通過轉染HOTAIR-siRNA，能夠有效抑制HOTAIR在細胞中的表達水平。在HOTAIR-siRNA靶向抑制組中，MTT實驗顯示細胞增殖能力明顯下降；Transwell實驗表明，HOTAIR表達被抑制后，子宮內膜癌細胞的遷移和侵襲能力明顯下降，推測HOTAIR的高表達與子宮內膜癌的發生、發展及侵襲轉移惡性生物學行為密切相關。

綜上所述，HOTAIR的高表達將促進子宮內膜癌細胞的轉移和侵襲，可能與子宮內膜癌的不良預后有關，提示其具有高度的轉移風險。因此，HOTAIR有望成為子宮內膜癌預后評價的生物學標志物及基因治療的新靶點。

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Influenceoflongchainnon-codingRNA(lncRNA)-HOTAIRonmigrationandinvasionabilityofendometrialcancer

WANG Ming-juan1, ZHOU Xiao-hui2, LIU Chao3

(1MorphologyExperimentalCenter,2DepartmentofBiochemistry,BasicMedicalCollege,ChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China;3DepartmentofCardiovascular,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China)

PurposeTo investigate the influence of long chain non-coding RNA (lncRNA)-HOTAIR on endometrial cancer cell proliferation, invasion, metastasis and other biological behaviour.Methods20 cases of endometrial carcinoma tissue specimen, 20 cases of hyperplasia tissue sample and 10 cases of normal tissue specimen were collected. Difference expression of lncRNA-HOTAIR in normal endometrium, hyperplasia endometrium tissue and endometrial carcinoma tissue at all periods were detected with RT-PCR assay. HOTAIR-siRNA transfection into Ishikawa cells was utilized with Lipofectamine 2000. MTT experiment was used to detected the proliferation ability of cells in all groups. Transwell chamber experiment was used to test the migration and invasion ability of cells in all groups.ResultsThe gene expression level of of lncRNA-HOTAIR in endometrial carcinoma group at all stages was prominently increased compared with normal endometrium group (P<0.05). The expression level of lncRNA-HOTAIR in simple hyperplasia endometrium group and atypical hyperplasia endometrial group was not significantly different (P>0.05). Cell proliferation, invasion ability and migration ability of HOTAIR-siRNA targeting suppression group were lower than the blank control group and the negative control group significantly (P<0.05).ConclusionlncRNA-HOTAIR may involved in occurrence and development of endometrial cancer, which may play an important role in the aggression and metastasis of endometrial cancer.

endometrial neoplasm； endometrial cancer； lncRNA-HOTAIR； siRNA； migration and invasion

時間：2017-7-18 11:51 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.007.html

河北省衛生計生委(ZD20140070)

1承德醫學院基礎醫學院形態學實驗中心、2生化教研室，承德 067000

3承德醫學院附屬醫院心臟內科，承德 067000

王明娟，女，碩士，實驗師。E-mail： 1390027337@qq.com

R 737.33

:A

:1001-7399(2017)07-0737-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.007

接受日期：2017-05-27