肺腺癌中PD-1、PD-L1蛋白表達與K-RAS基因突變狀態的相關性分析

王 珊，董麗儒，任會強，劉愛東，熊艷杰，宋旭東

肺腺癌中PD-1、PD-L1蛋白表達與K-RAS基因突變狀態的相關性分析

王 珊，董麗儒，任會強，劉愛東，熊艷杰，宋旭東

目的探討肺腺癌程序性死亡分子-1(programmed death 1, PD-1)、程序性死亡分子配體-1(programmed death ligand 1, PD-L1)蛋白的表達與K-RAS基因突變的相關性。方法采用免疫組化EnVision兩步法檢測PD-1、PD-L1蛋白的表達，應用實時熒光定量PCR技術檢測K-RAS基因的突變類型。結果肺腺癌組織中PD-1、PD-L1的陽性率均高于良性病變肺組織(P<0.01)，PD-1、PD-L1蛋白表達與患者性別、年齡、吸煙史、分化程度、淋巴結轉移及TNM分期均無相關性(P>0.05)。36例肺腺癌樣本中發生K-RAS基因突變者8例(22.2%)，K-RAS基因突變與患者性別、年齡、吸煙史、分化程度、淋巴結轉移及TNM分期均無關(P>0.05)。相關分析顯示PD-1、PD-L1蛋白表達與K-RAS突變無關(P>0.05)。結論PD-1、PD-L1蛋白在肺腺癌中的表達明顯高于良性病變肺組織，但兩者表達程度與肺腺癌的臨床病理特征及K-RAS基因突變無關。

肺腫瘤；腺癌；PD-1；PD-L1；K-RAS基因突變

肺癌是全球發病率最高的實體腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)所占比例最高，NSCLC又包括鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌。近年，肺癌的靶向治療以及免疫治療已成為臨床分析的熱點。程序性死亡分子-1(programmed death 1, PD-1)是主要表達在活化T細胞上的抑制性受體之一，與程序性死亡分子配體-1(programmed death ligand 1, PD-L1)結合，可顯著抑制T細胞的活化和增殖。最近，文獻報道EGFR突變的NSCLC高表達PD-L1蛋白[1]。本文著重探討肺腺癌中PD-1、PD-L1蛋白的表達及其與K-RAS基因突變的相關性。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集河北省唐山市人民醫院2015年9月～2016年2月及華北理工大學附屬醫院2012年1月～2016年6月接受肺癌根治術，且組織學證實為肺腺癌患者的石蠟標本36例。所有患者術前均未行放、化療，臨床病理資料完整。患者年齡41～76歲，中位年齡61歲。另隨機收集20例良性病變肺組織作為對照。

1.2主要試劑兔抗人單克隆抗體PD-1、PD-L1(Abcam公司)，石蠟包埋組織DNA提取試劑盒，購自北京天根公司；K-RAS基因突變檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自北京鑫諾美迪公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化 免疫組化采用EnVision兩步法，石蠟切片經二甲苯透明，梯度乙醇脫蠟至水，高壓修復后用3%H2O2封閉10 min，滴加一抗PD-1或PD-L1，4 ℃過夜；取出切片恢復至室溫，滴加二抗；37 ℃恒溫箱孵育30 min后滴加DAB顯色，蘇木精復染，分化，返藍，脫水，透明，封固。

1.3.2實時熒光定量PCR 按試劑盒說明書提取DNA，配制反應體系，將反應體系置于Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR基因擴增儀內進行擴增(表1)。PCR反應程序：預變性95 ℃ 3 min，循環1次，變性94 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 35 s，循環45次。通過Bio-Rad CFX Manager分析K-RAS突變結果。

1.4結果判斷

1.4.1PD-1結果判斷 PD-1主要表達于活化T細胞的胞質和胞膜，呈棕黃色粗顆粒狀。以細胞計數法評估，在低倍鏡下觀察整張切片，尋找高密度淋巴細胞，隨機選擇5個高倍視野，每視野計數100個淋巴細胞中PD-1陽性細胞數，并求其平均值作為PD-1陽性細胞數。以36例肺腺癌中PD-1陽性細胞數的均值作為閾值，大于該閾值為PD-1陽性，低于該閾值為PD-1陰性[2]。

1.4.2PD-L1結果判斷 PD-L1主要表達于腫瘤細胞的胞質和胞膜，呈棕黃色粗顆粒狀。采用二級記分法，按細胞著色程度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按細胞陽性比例評分：陽性細胞數≤2%為0分，2%～10%為1分，10%～50%為2分，>50為3分。最后將兩者相乘：得分>3分為陽性；≤3分為陰性[3]。

1.4.3K-RAS結果判斷 確定每個突變反應孔Ct值(CtM)和外控Ct值(CtW)，計算每個突變反應孔的△Ct(CtM - CtW)值，若△Ct≤8，且同時滿足CtW<30；即可確定樣本為突變型。

1.5統計學分析所有數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，PD-1、PD-L1蛋白表達及K-RAS基因突變狀態與肺腺癌臨床病理特征分析采用χ2檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1PD-1、PD-L1蛋白表達與肺腺癌臨床病理特征的關系36例肺腺癌中PD-1陽性率為50%(18/36)，PD-L1陽性率為44.4%(16/36)，良性病變肺組織中PD-1、PD-L1的陽性率均為0(0/20)。肺腺癌中PD-1、PD-L1的陽性率均高于良性病變肺組織(P<0.05，表2，圖1)。肺腺癌中PD-1、PD-L1蛋白表達與患者性別、年齡、吸煙與否、分化程度、淋巴結轉移及TNM分期均無關(P>0.05，表3)。

表1 K-RAS擴增引物序列

表2 PD-1、PD-L1蛋白在肺腺癌及良性病變肺組織中的表達

表3 PD-1、PD-L1蛋白表達與肺腺癌臨床病理特征的關系(n=36)

ABC圖1 A.肺腺癌的腫瘤細胞核質比增大,呈腺管樣結構排列;B.肺腺癌中PD-1呈陽性,EnVision兩步法;C.肺腺癌中PD-L1呈陽性,EnVision兩步法

表4 肺腺癌中K-RAS基因突變檢測(n=36)

表5 K-RAS基因突變與肺腺癌臨床病理特征的關系(n=36)

2.2K-RAS基因突變與肺腺癌臨床病理特征的關系36例肺腺癌中檢出K-RAS突變8例(表4，圖2)，突變率為22.2%。統計結果顯示K-RAS基因突變與患者性別、年齡、吸煙與否、分化程度、有無淋巴結轉移均無關(P>0.05，表5)。

2.3PD-1、PD-L1蛋白表達與K-RAS突變的相關性分析相關性分析表明，PD-1蛋白表達與K-RAS突變無關(r=0.134，P>0.05)；PD-L1蛋白表達與K-RAS突變無關(r=-0.075，P>0.05)。

圖2 肺腺癌K-RAS基因突變實時熒光定量PCR擴增分析 A.GGT>TGT；B.GGT>AGT；C.GGT>GTT；D.GGT>GAT

3 討論

人PD-1基因定位于染色體2q37.3，編碼免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，多表達于活化的T細胞。目前，PD-1的配體被證實有2個，分別為PD-L1和PD-L2，其中PD-L1是PD-1的主要配體，普遍表達于抗原提呈細胞、活化的T細胞及B細胞、內皮細胞等。PD-L1基因定位于染色體的9p24，編碼含有290個氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白。正常人體中，PD-1與PD-L1結合，使T細胞的活化被抑制，具有負性免疫調節作用[4]。由于正常T細胞表達PD-1，PD-L1在腫瘤細胞表面表達，故現階段文獻報道PD-L1較多。目前，關于PD-L1蛋白表達與肺癌臨床病理特征的關系報道不一致。Song等[5]發現PD-L1的表達與肺癌臨床病理特征均無相關性。宋燕秋等[6]實驗結果表明78例肺腺癌組織中PD-L1在女性、非吸煙及Ⅱ～Ⅲ期中的表達水平高于男性、吸煙者及Ⅰ期患者。本實驗結果顯示PD-1、PD-L1陽性率與患者性別、年齡、吸煙與否、分化程度、淋巴結轉移及TNM分期均無差異。文獻報道結論不一致，可能與免疫組化檢測PD-L1的陽性判讀標準不統一有關。Reck等[7]比較抗PD-1的靶向藥Pembrolizumab與鉑類為基礎的化療藥治療PD-L1陽性NSCLC患者，發現Pembrolizumab組無進展生存期和總生存期明顯延長。因此，免疫治療有望給更多NSCLC患者帶來希望。

K-RAS蛋白相對分子質量為2.1×104，故也被稱為p21蛋白。K-RAS蛋白位于細胞膜內面，具有內在GTP酶活性，K-RAS蛋白通過與GTP結合后被活化，參與調節細胞的生長、增殖。K-RAS基因突變后其編碼的p21蛋白活性降低，失去內在GTP酶活性，從而使信號傳導一直處于激活狀態，持續刺激細胞生長、發育、增殖，引起細胞惡變[8]。K-RAS基因突變率在人種之間存在差異，西方NSCLC人群中突變率較高，在肺腺癌中甚至達30%。亞洲NSCLC人群的突變率為4%～24%[9]。K-RAS基因突變主要發生于第2外顯子的12及13號密碼子上，其中12號密碼子的突變率(92%)明顯高于13號密碼子(8%)[10]。本實驗結果顯示，肺腺癌中K-RAS基因突變率為22.2%，均發生在12號密碼子，與上述文獻結果相符。目前，對K-RAS基因突變與肺癌臨床病理特征關系的相關分析尚未統一。Brcic等[11]分析273例肺腺癌患者的K-RAS基因狀態，發現吸煙者K-RAS突變率高于非吸煙者，K-RAS突變與患者性別、年齡、臨床分期均無關。張卉等[12]認為K-RAS基因突變與患者性別、年齡、分期、吸煙史無關。本實驗結果與國內學者報道相符，可能由于亞洲人群肺癌K-RAS突變率較低、樣本量不足導致抽樣有誤差。

目前，針對K-RAS基因突變患者的治療仍未找到理想靶向藥物。隨著免疫治療的不斷發展，K-RAS基因突變患者能否從免疫治療中獲益也成為研究的新方向。D’Incecco等[13]在122例NSCLC樣本中評估PD-1蛋白表達及K-RAS基因突變狀態，發現PD-1陽性與K-RAS突變狀態顯著相關，K-RAS基因突變的患者有更高的PD-1蛋白表達。有學者通過分析K-RAS基因突變的肺腺癌細胞系，發現阻斷K-RAS的下游通路可以減少腫瘤細胞表面PD-L1的表達。他們認為K-RAS所在的MAPK通路對細胞表面PD-L1蛋白表達起主導作用[14]。Ji等[15]結果顯示PD-1蛋白表達與K-RAS基因突變呈負相關。本組通過相關性分析，并未發現PD-1、PD-L1蛋白的表達與K-RAS突變存在相關性。

綜上所述，現階段K-RAS基因突變與PD-1、PD-L1表達的相關性報道各異，可能是由于K-RAS基因突變在人種之間的差異；另外，上述報道均采用免疫組化法檢測PD-1、PD-L1蛋白的表達，但目前尚無統一的陽性標準，也造成統計結果之間的差異。因此，對于K-RAS基因突變與PD-1、PD-L1蛋白表達之間的相關性，仍需更深入的分析。

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RelevantresearchofPD-1,PD-L1proteinexpressionandK-RASgenemutationsinlungadenocarcinoma

WANG Shan, DONG Li-ru, REN Hui-qiang, LIU Ai-dong, XIONG Yan-jie, SONG Xu-dong

(DepartmentofPathology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital,Tangshan063000,China)

PurposeTo investigate the association of the PD-1 and PD-L1 protein expression with K-RAS gene mutations in lung adenocarcinoma.MethodsThe protein expression of PD-1 and PD-L1 was detected by immunohistochemical EnVision two-step staining, the K-RAS mutation was examined by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsThe positive rate of PD-1 and PD-L1 was higher in lung adenocarcinoma than benign lung disease (P<0.01). There was no relationship between PD-1 and PD-L1 protein expression with the gender, age, smoking condition, differentiation, lymph node metastasis and TNM stages (P>0.05). The K-RAS gene mutations were detectable in 8 patients (22.2%) among 36 lung adenocarcinoma, there was no association between K-RAS gene mutation with the gender, age, smoking condition, differentiation, lymph node metastasis and TNM stages (P>0.05). The correction analysis showed that there was no relationship between PD-1 and PD-L1 protein expression with K-RAS mutation (P>0.05).ConclusionThe positive rate of PD-1 and PD-L1 is higher in lung adenocarcinoma than benign lung disease, but there is no relationship among PD-1 and PD-L1 protein expression with its clinal pathological characteristics and K-RAS mutation in lung adenocarcinoma.

lung neoplasm；adenocarcinoma；PD-1；PD-L1；K-RAS gene mutations

時間：2017-7-18 11:51 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.011.html

2016年河北省政府資助臨床醫學優秀人才培養和基礎課題研究(361036)

河北省唐山市華北理工大學附屬醫院病理科 063000

王 珊，女，碩士研究生。E-mail: 496874845@qq.com 宋旭東，男，教授，碩士生導師，主任醫師，通訊作者。E-mail: songxd2002@sina.com

R 734.2

:A

:1001-7399(2017)07-0754-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.011

接受日期：2017-05-22