非典型性脂肪瘤性腫瘤/高分化脂肪肉瘤MDM2蛋白表達和基因擴增檢測及臨床意義

潘丹玲，陳小巖，陳靈鋒，林 瀛

非典型性脂肪瘤性腫瘤/高分化脂肪肉瘤MDM2蛋白表達和基因擴增檢測及臨床意義

潘丹玲，陳小巖，陳靈鋒，林 瀛

目的探討非典型性脂肪瘤性腫瘤/高分化脂肪肉瘤(atypical lipomatous tumour/well-differentiated liposarcoma, ALT/WDL)中MDM2蛋白表達和基因擴增，分析MDM2蛋白表達和基因擴增在ALT/WDL中的意義。方法采用免疫組化EliVision兩步法及熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)檢測58例ALT/WDL中MDM2蛋白表達及基因擴增狀態。結果免疫組化檢測顯示58例ALT/WDL中MDM2蛋白陽性率為79.3%；FISH法檢測MDM2基因擴增率為96.5%。免疫組化和FISH檢測結果陽性率差異有統計學意義(P<0.05)。結論MDM2蛋白表達和MDM2基因擴增為ALT/WDL的診斷提供依據；由于免疫組化檢測陽性率接近80%，故在多數沒有FISH條件的單位予以開展免疫組化MDM2蛋白檢測，可以幫助診斷大多數ALT/WDL病例。

非典型性脂肪瘤性腫瘤/高分化脂肪肉瘤；MDM2；免疫組織化學；熒光原位雜交

非典型性脂肪瘤性腫瘤/高分化脂肪肉瘤(atypical lipomatous tumour/well-differentiated liposarcoma, ALT/WDL)是脂肪肉瘤中最常見類型，占脂肪肉瘤的40%～45%，好發于中老年人，發病年齡高峰為50～70歲，以男性多見，發生于腹膜后者以女性略多見[1]。ALT/WDL可發生于四肢皮下或深部軟組織，臨床上無特殊的癥狀和體征，起病多隱匿，緩慢性生長。ALT/WDL最重要的形態學依據脂肪母細胞診斷，但有時也難以查見典型的脂肪母細胞，因為脂肪母細胞也可出現在某些良性脂肪源性腫瘤內，因此ALT/WDL較難診斷。隨著影像學(如B超檢查)的發展，在B超引導下穿刺活檢的組織量少也極大地增加ALT/WDL診斷難度。本文現采用免疫組化EliVision兩步法檢測MDM2蛋白表達，應用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術檢測MDM2基因擴增狀態，探討兩者在ALT/WDL病理診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集福建省立醫院2010年1月～2015年12月手術或穿刺活檢的ALT/WDL組織標本58例，均經病理學明確診斷為ALT/WDL。其中脂肪瘤樣脂肪肉瘤35例，硬化性脂肪肉瘤18例，炎癥性脂肪肉瘤3例，梭形細胞性脂肪肉瘤2例；年齡39～82歲，平均(50±10)歲；腫物直徑4.2～20 cm；女性26例，男性32例。

1.2方法

1.2.1免疫組化 腫瘤標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片脫蠟，HE染色，免疫組化采用EliVision兩步法染色。MDM2抗體克隆號為SPM14，購自福州邁新公司。

1.2.2FISH法 標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，脫蠟，切片預處理，蛋白酶消化，固定，DNA變性，雜交，DAPI復染，信號計數。ZytoLight SPEC MDM2/CEN 12雙色探針試劑盒，購自德國ZytoVision GmbH公司。

1.3結果判斷

1.3.1免疫組化判斷 MDM2表達主要定位于細胞核，陽性腫瘤細胞核呈粗細不等、深淺不一的棕黃色顆粒即判為陽性。

1.3.2FISH判斷 隨機計數至少20個腫瘤細胞核中的雙色信號，根據MDM2試劑盒說明書判讀結果。細胞核內存在多個綠色信號或簇狀綠色信號提示MDM2基因擴增，本組56例MDM2高度擴增；正常細胞的間期細胞核為2個綠色和2個紅色信號，提示MDM2基因無擴增。

1.4統計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。采用連續校正χ2檢驗或Fisher精確概率法分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1組織學特征ALT/WDL從組織形態學可分為4種主要亞型：脂肪細胞性(脂肪瘤樣)、硬化性、炎癥性、梭形細胞性，且可以多種亞型并存。鏡下主要由相對成熟的增生脂肪組織構成，與良性脂肪源性腫瘤相比，細胞大小差異有顯著性(核局灶異型性、核深染)，可見數量不等的單泡或多泡脂肪母細胞。

2.2MDM2蛋白表達及基因擴增58例ALT/WDL中，MDM2蛋白陽性者46例，陽性率為79.3%(圖1)；56例MDM2基因擴增，擴增率為96.5%(圖2)。FISH檢測：46例MDM2蛋白陽性者MDM2基因均擴增；12例MDM2蛋白陰性者10例MDM2基因擴增，兩者相比差異有統計學意義(χ2=7.940，P=0.005，表1)。

表1 ALT/WDL中MDM2蛋白表達及基因擴增[n(%)]

①②A②B圖1 MDM2的表達,EliVi-sion兩步法圖2 A.MDM2基因擴增;B.MDM2基因無擴增

3 討論

WHO(2013)軟組織腫瘤分類及診斷標準系列將ALT/WDL確定為中間性腫瘤，ALT ICD-O編碼為8850/1，高分化脂肪肉瘤ICD-O編碼為8850/3。ALT/WDL定義為具有局部侵襲性的中間惡性間葉性腫瘤，腫瘤全部或部分由成熟脂肪組織構成，細胞大小差異有顯著性，且脂肪細胞和間質細胞的細胞核至少有局灶異型性。其中散在的深染核常為多核的間質細胞以及數量不等的單泡或多泡脂肪母細胞(存在單個或多個界限清楚的胞質內空泡，扇貝形分布于增大的深染核周圍)有助于診斷。病理學診斷主要依賴常規染色切片技術，經光鏡觀察細胞異型性和結構異常表現對ALT/WDL進行診斷。普遍認為脂肪母細胞是所有類型脂肪肉瘤的特征，但是應注意僅有脂肪母細胞不能診斷ALT/WDL，并非所有的ALT/WDL均有脂肪母細胞。ALT/WDL發生于深部者具有多次復發的可能，并可發生去分化和轉移。

ALT/WDL易與一些良性脂肪源性腫瘤混淆，尤其在穿刺活檢標本中，ALT/WDL的診斷難度增大。根據顯微鏡下腫瘤組織結構及細胞組成不同，ALT/WDL分為脂肪瘤樣脂肪肉瘤、硬化性脂肪肉瘤、炎癥性脂肪肉瘤、梭形細胞脂肪肉瘤4種亞型。在日常工作中，ALT/WDL需與以下疾病鑒別。(1)梭形細胞脂肪瘤/多形性脂肪瘤：其是同一組腫瘤的兩極表現，屬于少見特殊類型的良性脂肪性腫瘤，部分病例可單純為梭形細胞或多形細胞組成，大多數病例同時存在兩種形態學特征，有時與梭形細胞脂肪肉瘤較難鑒別。梭形細胞脂肪瘤/多形性脂肪瘤常位于頸、背部皮下組織，為無痛性結節，由不同數量的梭形細胞、核深染圓形細胞和多核巨細胞組成，梭形瘤細胞無明顯異型性，與脂肪細胞相互穿插，間質可見較粗膠原纖維束。ALT/WDL常位于肢體或腹膜后深部軟組織，鏡下可見核深染的異型間質細胞，腫瘤組織內缺乏粗大膠原纖維結構。梭形細胞脂肪瘤/多形性脂肪瘤免疫組化標記CD34呈陽性，MDM2呈陰性，MDM2基因無擴增，與ALT/WDL可資鑒別。(2)脂肪壞死及脂肪肉芽腫：有時與ALT/WDL難以鑒別，但脂肪壞死及脂肪肉芽腫鏡下見吞噬脂質的泡沫組織細胞，常伴多核巨細胞和炎癥細胞，無異型的脂肪母細胞，且MDM2蛋白不表達，MDM2基因無擴增，均可與ALT/WDL鑒別。(3)脂肪瘤病需與脂肪瘤樣脂肪肉瘤：脂肪瘤病可累及身體的不同部位，鏡下見脂肪組織彌漫性過度增生，主要是由成熟的脂肪細胞構成，脂肪細胞大小形態一致，無明顯異型細胞；脂肪瘤樣脂肪肉瘤常見于中老年人，腫瘤內可見核深染的異型脂肪母細胞，且MDM2蛋白表達、MDM2基因擴增，兩者可資鑒別。(4)其他腫瘤：硬化性脂肪肉瘤間質大量膠原性纖維，膠原纖維可伴玻璃樣變及鈣化，脂肪母細胞雖可見，但一般數量較少，故常與上述梭形細胞腫瘤難以鑒別，但是硬化性脂肪肉瘤鏡下可見核深染且異型的間質細胞散在分布于膠原纖維及脂肪細胞中，上述梭形細胞腫瘤組織均無脂肪細胞成分，MDM2蛋白一般不表達，雖偶可表達，但MDM2基因無擴增可資鑒別。

ALT/WDL的診斷與鑒別診斷需依賴于MDM2蛋白與MDM2基因檢測，由此可見免疫組化EliVision兩步法檢測MDM2蛋白表達與FISH法檢測MDM2基因擴增對ALT/WDL病理學診斷有重要意義。MDM2基因最初發現于小鼠的第10號染色體C1～C3 區，是從1個含有雙微體的自發轉化的BALB/3T3DM細胞中克隆出來的高度擴增基因，在自發轉化成纖維細胞中被發現。該自發轉化的每個細胞含有25～30雙微體，其經重組轉染后引起基因擴增。有文獻報道人MDM2基因位于染色體12q13-14區段，MDM2在細胞由G1期向S期過渡中起調控細胞周期進程的作用，其被認為能控制正常細胞的分化和增殖[2-3]，其編碼的蛋白質可以與p53蛋白結合，負性調節p53蛋白引起腫瘤發生[4]。ALT/WDL細胞遺傳學特征是顯示超額環狀染色體和巨染色體，其中含有擴增的12q13-15序列，這一區域最恒定的擴增是MDM2基因[5-7]。

本組ALT/WDL中MDM2蛋白陽性率為79.3%，MDM2基因擴增率為96.5%，與國外文獻[8-12]報道一致，提示免疫組化檢測MDM2蛋白及FISH技術檢測MDM2基因是ALT/WDL有效的輔助診斷手段。Binh等[9]也同時發現部分惡性間葉性腫瘤，如惡性纖維組織細胞瘤、平滑肌肉瘤、黏液性脂肪肉瘤等，MDM2蛋白也可表達，但這些惡性間葉源性腫瘤并不存在MDM2基因擴增。提示作為ALT/WDL診斷的輔助手段，MDM2蛋白敏感性好但特異性差，對于某些難以診斷的ALT/WDL，如果MDM2的免疫組化不足以支持診斷，或者免疫組化結果與其他臨床病理特征不符時，可使用FISH技術檢測進一步確診。值得注意的是，待檢組織中腫瘤成分的多少及標本處理等均會影響檢測結果；同時石蠟組織保存時間越久，提取DNA的效果越不理想。本組有2例MDM2基因無擴增均為穿刺活檢小標本，分析原因可能是真陰性，也可能是技術或標本質量原因造成的假陰性，或者是穿刺活檢小標本鏡下腫瘤組織極少，因腫瘤的異質性造成的假陰性。

本實驗ALT/WDL中MDM2蛋白陽性率為79.3%，MDM2基因擴增率為96.5%；MDM2基因陽性組明顯高于MDM2陰性組(P<0.01)，差異具有統計學意義，提示MDM2蛋白的表達和基因擴增為ALT/WDL的診斷提供依據，MDM2基因擴增作為獨特的分子標志物在ALT/WDL的診斷中具有較高的敏感性和特異性。由于本組免疫組化EliVision兩步法檢測MDM2蛋白陽性率高，故在大多數無FISH條件的醫院行免疫組化標記MDM2蛋白的檢測，可以幫助診斷大多數ALT/WDL患者。

[1] 韓安家，賴日權，主編. 軟組織腫瘤病理學[M]. 北京：科學出版社, 2015:148-152.

[2] Tauber H, Wurl P, Meye A,etal. Molecular and immunohistochemical p53 status in liposarcoma and malignant fibrous histiocytoma: identification of seven new mutations for soft tissue sarcomas[J]. Cancer, 1995,76(7):1187-1196.

[3] 苗海港，邱法波，李贊濱，等. c-myc、MDM2及p53 基因在原發性腹膜后脂肪肉瘤中的表達及臨床意義[J]. 中國現代普通外科進展, 2014,17(5):361-365.

[4] Harris S L, Levine A J. The p53 pathway: positive and negative feedback loops[J]. Oncogene, 2005,24(17):2899-2908.

[5] Hostein I, Pelmus M, Aurias A,etal. Evaluation of MDM2 and CDK4 amplification by real-time PCR on paraffin wax-embedded material: a potential tool for the diagnosis of atypical lipomatous tumours/well-differentiated liposarcomsa[J]. J Pathol, 2004,202(1):95-102.

[6] Tamborini E, Della T G, Lavarino C,etal. Analysis of the molecular species generated by MDM2 gene amplification in liposarcomas[J]. Int J Cancer, 2001,92(6):790-796.

[7] Micci F, Teixeira M R, Bjerkehagen B,etal. Characterization of supermumerary rings and giant narker chromosomes in well-differentiated lipomatous tumors by a combination of G-banding, CGH, M-FISH,and chromosome and locus-specific FISH[J]. Cytogenet Genome Res, 2002,97(97):13-19.

[8] Weaver J, Rao P, Goldblum J R,etal. Can MDM2 analytical tests performed on core needle biopsy be relied upon to diagnose well-differentiated liposarcoma[J]. Mod Pathol, 2010,23(10):1301-1306.

[9] Binh M B, Sastre Garau X, Guillou L,etal. MDM2 and CDK4 immunostainings are useful adjuncts in diagnosing well-differentiated and dedifferentiated liposarcoma subtypes: a comparative analysis of 559 soft tissue neoplasms with genetic data[J]. Am J Surg Pathol, 2005,29(10):1340-1347.

[10] Lokka S, Scheel A H, Dango S,etal. Challenging dedifferentiated liposarcoma identified by MDM2-amplification, a report of two cases[J]. BMC Clin Pathol, 2014,14:36.

[11] Kashima T, Halai D, Ye H,etal. Sensitivity of MDM2 amplification and unexpected multiple faint alphoid 12 (alpha 12 satellite sequences) signals in atypical lipomatous tumor[J]. Mod Pathol, 2012,25(10):1384-1396.

[12] Weaver J, Downs-Kelly E, Goldblum J R,etal. Fluorescence in situ hybridization for MDM2 gene amplification as a diagnostic tool in lipomatous neoplasms[J]. Mod Pathol, 2008,21(8):943-949.

ClinicalsignificanceofMDM2proteinexpressionandgeneamplificationinatypicallipomatoustumour/well-differentiatedliposarcoma

PAN Dan-ling, CHEN Xiao-yan, CHEN Ling-feng, LIN Ying

(DepartmentofPathology,FujianProvincialHospital,ProvincialClinicalMedicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

PurposeThis study was to investigate the clinical significance of MDM2 protein expression and gene amplification in atypical lipomatous tumour/well-differentiated liposarcoma (ALT/WDL).MethodsMDM2 protein expression and gene amplification were detected by immunohistochemistry of EliVision two-step method and fluorescence in situ hybridization (FISH) in 58 cases of ALT/WDL.ResultsImmunohistochemical staining showed that the positive rate of MDM2 was 79.3%, MDM2 gene amplification rate by FISH assay was 96.5%. There was statistically significant differences between immunohistochemistry and FISH (P<0.05).ConclusionMDM2 protein expression and MDM2 gene amplification provide the basis for diagnosis of ALT/WDL. However, a positive rate of MDM2 by immunohistochemistry is nearly 80%, so we recommand to carry out immunohistochemical MDM2 protein detection in most conditions without FISH which can help in the diagnosis of most cases of ALT/WDL.

atypical lipomatous tumour/well-differentiated liposarcoma； MDM2； immunohistochemistry； fluorescence in situ hybridization

時間：2017-7-18 11:51 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.012.html

福建醫科大學省立臨床醫學院福建省立醫院病理科，福州 350001

潘丹玲，女，副主任醫師。E-mail： pandanling0909@sina.com 陳小巖，女，教授，主任醫師，通訊作者。E-mail： fjslyyblk@sina.com

R 738.6

:A

:1001-7399(2017)07-0759-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.012

接受日期：2017-05-17