甲狀腺乳頭狀癌中B-raf基因V600E突變的檢測方法對比分析

陽 宇，杜曉華，劉 影，鄭細閏，鄭廣娟

甲狀腺乳頭狀癌中B-raf基因V600E突變的檢測方法對比分析

陽 宇，杜曉華，劉 影，鄭細閏，鄭廣娟

甲狀腺腫瘤；乳頭狀癌；B-raf；V600E

甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤，女性多于男性，約90%甲狀腺癌為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)[1]。近年，甲狀腺癌的發病率呈上升趨勢，B-raf基因與PTC密切相關，最多見的突變位點為V600E，是目前分析和檢測的熱點[2]。本文回顧性分析136例PTC的B-raf基因V600E突變，并采用免疫組化Ventana BenchMark法和RT-PCR法進行檢測，分析兩種方法的一致性，探討在未能開展基因檢測的醫院單獨行免疫組化法檢測的可行性和必要性。

1 材料與方法

1.1材料選取2016年4月～11月廣東省中醫院病理科診斷的136例PTC組織，所有標本均同步行B-raf基因V600E突變的免疫組化法染色和RT-PCR檢測。

1.2試劑DNA提取試劑盒(廣州寶創公司)；人類B-raf基因V600E突變檢測試劑盒(武漢海吉力公司)；超微量分光光度計ND-8000(Thermo Scientific公司)；RT-PCR檢測儀(ABI公司)。石蠟包埋組織切片機、全自動染色機(Leica公司)；羅氏診斷B-raf V600E(VE1)抗體；全自動免疫組化儀(Ventana BenchMark)。

1.3方法

1.3.1免疫組化染色 常規2～3 μm厚切片，運用Ventana BenchMark全自動免疫組化儀進行檢測；一抗選用羅氏診斷B-raf V600E(VE1)抗體，陽性判讀標準為腫瘤細胞胞質著色，并設有陰陽性對照。

1.3.2RT-PCR 通過病理診斷選取腫瘤細胞富集的蠟塊進行常規切片，4 μm厚切片，合計10張。采用Biotron DNA提取試劑盒進行提取DNA，并應用ND-8000超微量分光光度計對提取的DNA進行濃度及質量測定，其符合標準為1.7

2 結果

2.1RT-PCR與免疫組化法染色檢測PTC經RT-PCR檢測內參基因擴增的同時，B-raf目標基因與陽性對照也擴增，而陰性對照無擴增(圖1)。免疫組化Ventana BenchMark法染色結果顯示，PTC腫瘤細胞胞質經DAB染色呈棕色，細胞核經蘇木精染色呈藍色(圖2)。

圖1 RT-PCR檢測B-raf基因V600E突變

黑色為檢測標本目標基因，藍色為內參，紅色為陽性對照，綠色為陰性對照

圖2免疫組化檢測B-raf基因V600E突變：B-raf基因V600E突變在PTC腫瘤細胞胞質呈棕色，細胞核藍染，Ventana BenchMark法

2.2RT-PCR與免疫組化染色分析兩種方法檢測的陽性率均為83.82%(114/136)，其中兩種方法檢測的陽性符合率為99.1%(113/114)，陰性符合率為95.5%(21/22)。另外，免疫組化染色陽性而RT-PCR陰性1例；免疫組化染色陰性而RT-PCR陽性1例(表1)。

表1 免疫組化和RT-PCR檢測BRAF V600E突變分析

3 討論

PTC中B-raf基因V600E突變的檢測對乳頭狀不典型增生的鑒別診斷有較好的指導作用[3]，也與臨床手術切除范圍、治療及預后密切相關[4-5]。因此，對其檢測非常必要。RT-PCR法是目前B-raf基因V600E位點突變應用較廣泛的檢測技術，其檢測靈敏性和特異性均高于免疫組化法。本實驗對RT-PCR和免疫組化染色法結果進行分析，兩者結果的陰、陽性符合率均較高，但仍有2例不符合。作者對2例不符合病例進行深入分析，發現其中1例免疫組化染色陰性標本，當時在做免疫組化染色時未設陽性對照，其陰性的真實性值得推敲。對該標本進行第2次免疫組化染色，設置陽性對照，結果顯示B-raf基因V600E突變，與RT-PCR陽性結果一致。另1例免疫組化染色小灶陽性的標本因為色素的影響，導致病理醫師誤判為小灶陽性，經RT-PCR檢測確定其陰性。結果修正判讀后，免疫組化染色結果與RT-PCR檢測結果符合率達100%，與中國醫學科學院腫瘤醫院應建明教授團隊的研究結果高度一致[6]。

綜上所述，RT-PCR法檢測PTC的B-raf基因V600E突變結果穩定，是臨床檢測的首選方法；免疫組化染色由于特異性和靈敏性均較低，可能會對檢測結果產生偏差；但只要在檢測過程中避免影響免疫組化染色非特異性的因素，并選取正確的陽性對照，其對于未能開展分子檢測的病理科或實驗室也是較好的初篩工具，對PTC的預后和治療均有一定的指導作用。

[1] 李小強，張惠箴，蔣智銘，等. 甲狀腺乳頭狀癌中BRAF基因的表達及意義[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2012,28(9):991-995.

[2] 黃 偉，吳高松. 甲狀腺癌相關BRAF基因研究的新進展[J]. 中國普通外科雜志, 2010,19(5):559-563.

[3] 張 翼，李 惠，陳 劼，等. BRAF基因突變檢測在甲狀腺乳頭狀病變中的臨床意義[J]. 中外醫療, 2014,33(9):15-17.

[4] Eloy C, Santos J, Soares P,etal. The preeminence of growth pattern and invasiveness and the limited influence of BRAF and RAS mutations in the occurrence of papillary thyroid carcinoma lymph node metastases[J]. Virchows Archiv, 2011,459(3):265-276.

[5] Xing M, Alzahrani A S, Carson K A,etal. Association between BRAF V600E mutation and mortality in patients with papillary thyroid cancer[J]. JAMA, 2013,309(14):1493-1501.

[6] Qiu T, Lu H, Guo L,etal. Detection of BRAF mutation in Chinese tumor patients using a highly sensitive antibody immunohistochemistry assay[J]. Sci Rep, 2015,5:9211.

時間：2017-7-18 11:52 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1152.029.html

廣東省中醫院病理科，廣州 510120

陽 宇，男，碩士，醫師。Tel:(020)39318331，E-mail：729195014@qq.com 鄭廣娟，女，教授，主任醫師，通訊作者。E-mail：zhengguangjuan@163.com

R 394-33

:B

1001-7399(2017)07-0815-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.029

接受日期：2017-05-26