基于肝竇內皮細胞損傷評價黃芪來源成分的防護作用*

趙志敏黃 愷孫 鑫沈 麗劉成海，，3△

1.上海市中醫臨床重點實驗室（上海，201203） 2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝病研究所 3.上海高校中醫內科學E-研究院

·實驗研究·

基于肝竇內皮細胞損傷評價黃芪來源成分的防護作用*

趙志敏1黃 愷1孫 鑫2沈 麗2劉成海1，2，3△

1.上海市中醫臨床重點實驗室（上海，201203） 2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝病研究所 3.上海高校中醫內科學E-研究院

目的：觀察黃芪來源成分對氯化鈷誘導SK-HEP-1細胞缺氧損傷的防護作用。方法：800μM氯化鈷作用于SK-HEP-1細胞24小時，誘導細胞缺氧損傷，不同濃度的藥物成分作用于SK-HEP-1細胞，MTT法檢測細胞活力，免疫熒光染色檢測細胞vWF表達，高內涵圖像分析系統觀察細胞膜通透性、細胞核形態及溶酶體變化，熒光探針法檢測NO、NOS水平。結果：與正常組比較，模型組細胞活力顯著下降，vWF表達明顯增加，細胞溶酶體平均熒光強度明顯減弱，NO、NOS水平顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）；藥物處理后，細胞活力明顯改善（P＜0.01），其中黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ組vWF表達顯著下降，溶酶體和NO水平顯著提高（P＜0.05）；毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷組vWF表達、溶酶體顯著改善（P＜0.05）；芒柄花素和芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷組細胞NO、NOS水平顯著提高，芒柄花素組細胞溶酶體熒光顯著增強（P＜0.05）。結論：黃芪來源的7種成分均有防護氯化鈷誘導的SK-HEP-1細胞缺氧損傷的作用，但其作用基礎存在細胞生物學差異。

黃芪來源成分；肝竇內皮細胞；缺氧損傷；防護作用

黃芪味甘、性微溫，歸脾、肺經，具有補氣升陽，益氣固表，托毒生肌，利水退腫的功效。黃芪及其提取物對肝纖維化具有良好的治療作用［1，2］，其作用機制與改善肝臟血管損傷及肝竇毛細血管化有關［3］。肝竇內皮細胞（LSEC）是肝臟微血管的主要組成細胞之一，對缺血缺氧最為敏感。我們通過采用具有肝竇內皮細胞特征的SK-HEP-1細胞建立氯化鈷誘導的缺氧損傷模型，進一步研究黃芪來源成分對改善肝竇內皮細胞缺氧損傷的防護作用，以期發現其活性成分。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 黃芪來源藥物成分7種（黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷、芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷、芒柄花素），購自上海融禾醫藥科技發展有限公司；六水合氯化鈷（CoCl2·6H2O，Cat＃080M0101V）、噻唑藍購自Sigma公司；MEM干粉（Cat＃41500-067）、胎牛血清（FBS，Cat＃10099）購自GIBCOTM公司；兔vWF多克隆抗體（ab6994）購自Abcam公司；細胞毒性2試劑盒（Cat＃8400101），購自ThermoFisher；DAF-FM DA［一氧化氮（NO）熒光探針，Cat＃S0019］、DAPI細胞核染色液、抗兔FITC熒光二抗（P0186）購自碧云天生物技術研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 SK-HEP-1細胞培養及化學缺氧損傷模型制備 SKHEP-1人內皮細胞購自ATCC，為人內皮來源的腹水瘤細胞，具備肝竇內皮的窗孔和內吞特性［4］，常規培養于含10%胎牛血清的MEM培養液。以每孔8000個細胞接種于96孔板，待細胞密度為70%左右，每孔加入100μl終濃度800μM的CoCl2·6H2O培養液，孵育24h誘導細胞損傷。

1.2.2 SK-HEP-1細胞分組與處理 每個藥物單體成分均在160μM范圍內設6個濃度梯度確定對SK-HEP-1細胞的最大無毒范圍（與不加藥組細胞比存活率＞90%），根據最大無毒濃度再分設3個濃度梯度分別作用于細胞模型。各藥物與細胞共孵育24h同時添加800μM CoCl2·6H2O。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力 細胞接種于96孔板，長至亞單層，棄原培養液，換為各藥物成分培養液，100μl/孔，每組4－6個復孔，孵育24h。棄藥物培養液，加入0.5mg/ml MTT工作液，孵育4h。可見藍紫色結晶，小心吸棄工作液，加入DMSO 100μl/孔，至充分溶解，在微孔板掃描分光光度計上測定吸光度OD490。

1.2.4 免疫熒光法檢測細胞活力 4%多聚甲醛室溫固定細胞15min，PBS洗滌，0.5%Triton X-100孵育10min，5%BSA/PBS 37℃封閉30mim，vWF一抗（1∶200）37℃孵育1h，PBS洗滌，熒光二抗（1∶100）37℃孵育1h，PBS洗后滴加DAPI染核5mim，PBS洗滌，Cellomics ArrayScan VTIHCSReader采集圖像，Cellomics Cell Health Profiling BioApplication Software對圖像進行分析。

1.2.5 細胞核形態、細胞膜通透性及溶酶體數量高內涵檢測

親核綠色熒光染料標記細胞膜，紅色熒光染料標記溶酶體，4%甲醛室溫固定15 min，PBS洗滌兩次，DAPI標記細胞核，PBS洗滌兩次，圖像采集和分析同1.2.4。

1.2.6 熒光探針法檢測一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）水平 藥物孵育后棄原培養液，原位裝載NO或NOS探針，100μl/孔。37℃細胞培養箱內孵育20～40min。PBS洗3次。Thermo scientific varioskan flash光譜掃描多功能讀數儀上檢測，使用495nm激發波長，515nm發射波長。

1.3 統計學方法 所有數據均使用SPSS 12.0軟件包進行統計學分析，計量資料用±s表示。組間比較使用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有顯著性意義。

2 結果

2.1 各藥物成分對SK-HEP-1細胞氯化鈷損傷模型細胞活力的影響

藥物作用24小時各化合物對SK-HEP-1細胞最大無毒濃度分別為：黃芪甲苷20μM、黃芪皂苷Ⅰ10μM、黃芪皂苷Ⅱ5μM、毛蕊異黃酮20μM、毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷5μM、芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷10μM、芒柄花素5μM。造模后，模型組細胞活力較正常組顯著下降（P＜0.01）；黃芪甲苷（5μM）、黃芪皂苷Ⅰ（2.5μM、5μM、10μM）、黃芪皂苷Ⅱ（1.25μM、2.5μM）、毛蕊異黃酮（5μM）、毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷（1.25μM、5μM）、芒柄花素（1.25μM）、芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷（2.5μM）組SK-HEP-1細胞活力明顯提高（P＜0.01），見圖1。

圖1 各藥物成分對SK-HEP-1細胞氯化鈷損傷模型細胞活力的影響比較

2.2 各藥物成分對SK-HEP-1細胞氯化鈷損傷模型細胞vWF表達的影響

vWF免疫熒光染色顯示，模型組細胞熒光強度較正常組顯著升高（P＜0.05）；黃芪甲苷（10μM、20μM）、黃芪皂苷Ⅱ（2.5μM）、毛蕊異黃酮（5μM）、毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷（2.5μM、5μM）組vWF熒光強度有不同程度的降低（P＜0.05），差異具有顯著性意義，見插頁圖2。

圖2 各成分對SK-HEP-1細胞氯化鉆損傷模型細胞vWF表達的影響圖

2.3 各藥物成分對SK-HEP-1細胞氯化鈷損傷模型細胞核形態、細胞膜通透性及溶酶體的影響

高內涵檢測結果顯示，與正常組比較，模型組細胞核面積增大、平均熒光強度降低，細胞膜通透性增高，溶酶體平均熒光強度減弱（P＜0.05）；與模型組比較，各成分對細胞核形態及細胞膜通透性無明顯影響（P＞0.05）；黃芪甲苷（5μM）、黃芪皂苷Ⅱ（5μM）、毛蕊異黃酮（5μM、10μM、20μM）、毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷（2.5μM、5μM）、芒柄花素（5μM）組細胞溶酶體平均熒光強度顯著增強（P＜0.05），見插頁圖3。

圖3 各成分對SK-HEP-1細胞氯化鉆損傷模型細胞核形態、細胞膜通透性及溶酶體數量的影響圖

2.4 各藥物成分對SK-HEP-1細胞氯化鈷損傷模型細胞NO、NOS的影響

NO、NOS熒光探針檢測結果顯示，模型組細胞NO、NOS表達較正常組明顯降低（P＜0.01）；黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ、芒柄花素、芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷能夠顯著增加氯化鈷損傷模型SK-HEP-1細胞NO、NOS的表達，差異具有顯著性意義（P＜0.05或P＜0.01），見圖4。

圖4 各藥物成分對SK-HEP-1細胞氯化鈷損傷模型細胞NO、NOS的影響比較

3 討論

肝臟受損和炎癥時常伴有缺氧現象，肝竇內皮細胞是缺氧的感受器，其改變往往早于大部分慢性肝病的發展，任其進一步發展將加重肝臟疾病如纖維化并形成難以逆轉的血管病理。缺氧損傷條件下，肝竇內皮細胞會發生表型變化，窗孔破壞、減少或消失，vWF表達增高；活性氧生成提高，細胞膜通透性增強，細胞核大小和形態發生改變，溶酶體膜的完整性受損，溶酶體內容物的釋放甚至大于溶酶體的崩解引起細胞凋亡或壞死［5］。LSEC具有合成和分泌NO的功能，可通過NO-環磷鳥苷通路維持LSEC窗孔和表型，抑制星狀細胞活化，從而調節肝竇和血管的舒張。實驗證實肝硬化時LSEC功能紊亂，NO水平下降［6］。氯化鈷化學誘導細胞缺氧損傷是體外研究常用的技術方法，廣泛應用于神經細胞、癌細胞、血管內皮細胞及平滑肌細胞缺氧研究［7］。我們前期采用氯化鈷誘導SK-HEP-1構建缺氧損傷模型，篩選并發現了部分抗肝竇內皮細胞缺氧損傷的中藥活性成分［8］。在本實驗中，SK-HEP-1細胞經氯化鈷缺氧損傷處理后，表型標志物vWF表達增多，細胞膜通透性增強，溶酶體平均熒光強度顯著下降，細胞核形態及大小出現改變，細胞活力顯著下降。

黃芪是臨床有效治療肝纖維化的中藥復方如當歸補血湯、黃芪湯、復方861等方劑中的主要組成藥味，其抗肝纖維化作用機制主要在于抗脂質過氧化、抑制星狀細胞增殖、調節基質金屬蛋白酶表達、抑制膠原合成和沉積等。黃芪及其提取物如黃芪總皂苷、黃芪總黃酮等多見于心腦血管疾病的研究，其有效成分可通過抑制細胞內皮素分泌、增加NO釋放、維護細胞連接的完整性、抑制凋亡和促進增殖和遷移等保護內皮細胞功能［9］。對于肝竇內皮細胞這一特殊血管內皮的研究較少，李娟梅等發現黃芪多糖可通過影響肝竇內皮細胞微區力學、增加NO合成從而改善肝臟微循環［10］。本研究發現黃芪來源的7種單體成分對缺氧損傷的SK-HEP-1細胞活力有明顯改善作用，其中皂苷類的黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ對抑制vWF表達、保護細胞溶酶體、改善細胞NO合成功能有明顯作用；黃酮類的毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷對vWF表達、細胞溶酶體有效，但對NO無明顯影響；而同是黃酮類的芒柄花素和芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷對NO合成有明顯改善作用，芒柄花素還可保護細胞溶酶體，但兩者對細胞vWF表達無明顯影響。綜上所述，實驗初步發現7種成分均有防護氯化鈷誘導的SK-HEP-1細胞缺氧損傷的作用，但存在作用差異，對其機制的深入研究將對慢性肝病的治療具有特殊意義。

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［10]李娟梅.黃芪多糖對肝竇內皮細胞微區力學性質影響的研究［D］.中國中醫科學院，2013.

Evaluation the protective effects of the com pounds from astragalus based on liver sinusoid endothelial cell injury

ZHAO Zhi-Min1，HUANGKai1，SUN Xin2，LIUCheng-Hai1，2，3△，etal.1.Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine（Shanghai，201203）China

Objective：To observe the effects of the components from Astragalus on protecting SK-HEP-1 cells from hypoxia injury induced by cobaltous chloride（CoCl2）.M ethods：SK-HEP-1 cell hypoxia injury was induced by 800μM CoCl2 for24 hours，and the cellswere treated with different concentrations of components.Cell viability wasmeasured by MTT assay，vWF was detected by immunofluorescence staining，themembrane permeability，nuclearmorphology and lysosomal changeswere observed by high content screen（HCS）system，NO and NOSwere detected by fluorescence probemethod.Results：Compared with the control group，800μM CoCl2 decreased cell viability extremely，the expression of vWF increased significantly，themean fluorescence intensity of lysosomes，NO and NOSdecreased significantly（P＜0.05 orP＜0.01）.After treatment，cell viability was significantly improved in different groups（P＜0.01）.The expression of vWF was decreased while lysosomes and NO levels increased significantly in AstragalosideⅣand AstragalosideⅡgroups（P＜0.05）；in Calycosin and Genistein-7-O-b-D-glucoside groups，the expression of vWF was decreased but lysosome was improved significantly（P＜0.05）；NO and NOS levels in Formononetin and Ononin groups increased significantly，lysosomes in formononetin group were also significantly enhanced（P＜0.05）.Conclusion：The 7 compounds from astragalus have protective effects on SK-HEP-1 cells hypoxia injury induced by CoCl2，but there are some differences in cell biology.

sinusoidal endothelial cells；hypoxia injury；activity evaluation

2017－04－17 編輯：黃育華）

10.3969/j.issn.1005－0264.2017.03.011

國家自然科學基金（No.81473404）；中國博士后基金；△通訊作者：E-mail：chenghailiu＠hotmail.com