上皮性卵巢癌病人外周血循環腫瘤細胞與栓塞的相關性研究

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上皮性卵巢癌病人外周血循環腫瘤細胞與栓塞的相關性研究

張玲，喬翠峰，杜秀萍

目的利用免疫磁珠法富集上皮性卵巢癌合并靜脈血栓(VET)病人外周血循環腫瘤細胞(CTCs)，觀察血液CTCs水平與病人靜脈血栓的相關性。方法采集2016年1月—2017年1月確診的62例卵巢癌合并VET病人外周血，應用免疫磁珠法富集上皮性卵巢癌病人的外周血循環腫瘤細胞，研究CTCs水平與病人栓塞的關系。結果62例上皮性卵巢癌合并VET病人47例為CTCs陽性，CTCs陽性率與上皮性卵巢癌病人的年齡、腫瘤部位、TNM分期及纖維蛋白原無關(P>0.05)；與CA125、血小板數量及抗凝血酶Ⅲ密切相關，差異有統計學意義(P<0.05)。結論CTCs監測可能為預測卵巢癌病人靜脈栓塞的有效方法。

上皮性卵巢癌；循環腫瘤細胞；栓塞

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，其主要死因是腫瘤細胞的遠處轉移及腫瘤相關性栓塞癥[1-2]。卵巢癌病人發生靜脈血栓栓塞(VTE)包括深靜脈血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)的風險較非腫瘤病人高數倍。有文獻表明：外周血循環腫瘤細胞高的腫瘤病人血栓風險升高[3-4]。

近年來，新興循環腫瘤細胞檢測技術，可幫助腫瘤病人了解外周血腫瘤細胞情況，盡早預測腫瘤病人發生血栓的可能性。外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是指自發或診療操作手段由腫瘤原病灶或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞[5 ]。檢測腫瘤細胞相當于“體液活檢”，為病人提供重要的病情信息。但CTCs在血液中受到大量正常血細胞干擾，因此需要敏感的CTCs收集鑒定檢測手段[6]。上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecular，EpCAM)是一種由GA-733-2基因編碼的分子量為40 kDa的跨膜糖蛋白，作為嗜同種的鈣非依賴性上皮細胞間黏附分子在上皮癌變過程中發揮作用。本研究采用EpCAM結合超順磁性免疫磁珠在磁場磁力作用下與其他物質分離，從而收集腫瘤細胞[7]，通過EpCAM免疫磁珠富集法收集上皮性卵巢癌合并VET病人外周血中CTCs，以期了解CTCs水平與卵巢癌病人VET的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集山西省腫瘤醫院婦產科2016年1月—2017年1月上皮性卵巢癌病人62例，年齡20歲～60歲，平均42.7歲。納入標準：病理診斷為上皮性卵巢癌。排除標準：同時合并其他原發惡性腫瘤；未接受手術治療或手術后未未化療；未完成整個化療期周期的。對照組為同期就診的20例卵巢癌病人，年齡20歲～60歲，平均年齡44.5歲。

1.2 主要試劑 抗EpCAM免疫磁球購于上海美吉生物有限公司，CD45-PE和CK19/FITC標記抗體購于上海瑞齊生物科技有限公司，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diami-no-2-phenylindole，DAPI)購自美國Sigma公司?？偰懝檀肌Ⅳ燃谆鶜ぞ厶鞘榛句@鹽(HQCMC)、1，2-二油?；字Ｄ憠A(DOPC)、二氯甲烷、二價鐵鹽(FeSO4·7H2O)、三價鐵鹽(FeCl3·6H2O)、NH3·H2O、N-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)等常用試劑均購自上海美吉生物有限公司。人卵巢癌細胞株SKOV3購于上海江林生物科技公司。

1.3 循環腫瘤細胞檢測方法

1.3.1 標本采集 采血前24 h禁高脂高糖飲食。抽血時病人處于安靜狀態，空腹，取坐位。從肘正中靜脈用EDTA抗凝劑真空采血管抽取全血樣本7.5 mL。采血后重新編號，放入4 ℃冰箱暫存，24 h內進行檢測。

1.3.2 免疫磁珠富集法 將收集的卵巢癌病人的外周血放至10 mL離心管中，置于離心機中，1 500 r/min離心15 min；離心后，轉移上面第一層和第二層內所有液體至 10 mL離心管A中；在離心管A中加等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻；加入抗EpCAM免疫磁球，孵育1 h，每隔10 min混勻一次；將離心管放在磁力架上，磁分離15 min，丟棄上清，并加1 mL PBS洗滌磁球；滴加CK19-FITC 15 μL，CD45-PE 15 μL，DAPI 25 μL 37 ℃下避光孵育1 h。加2 mL PBS洗滌，磁分離15 min，加入50 μL雙蒸水重懸涂片；以對數正常生長的卵巢癌細胞株為陽性對照，以PBS代替抗體作為陰性對照。在熒光顯微鏡計數腫瘤細胞數并記錄結果。

1.3.3 CTCs判定標準 腫瘤細胞體積大于周圍白細胞，核較大或小，核漿比例較大，核分裂增多；在熒光顯微鏡下觀察，DAPI(+)、CK19(+)、CD45(-)為CTCs。

1.4 實驗室檢測指標 纖維蛋白原(fibrinogen，FIB)、D-二聚體(D-Dimer)、抗凝血酶-Ⅲ(Antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ)采用貝克曼ACL TOP700儀器加IL試劑盒檢測，血小板計數(platelet count，PLT)采用貝克曼LH750儀器檢測。

2 結 果

2.1 卵巢癌病人CTCs檢測結果 對照組外周血中檢出CTCs為30.0%(6/20)，卵巢癌合并VET病人外周血中檢出CTCs為75.8%(47/62)，兩組陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 卵巢癌CTCs免疫熒光染色結果(見圖1)

圖1 CTCs免疫熒光染色結果

2.3 卵巢癌CTCs與各指標的相關性 CTCs陽性率與上皮性卵巢癌病人的年齡、腫瘤部位、TNM分期及纖維蛋白原無關(P>0.05)；而與CA125、血小板數量及抗凝血酶Ⅲ密切相關，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 卵巢癌CTCs與各指標的相關性 例

3 討 論

CTCs是存在于外周血中的各類腫瘤細胞統稱，由于自發或診療操作從實體腫瘤病灶(原發灶、轉移灶)脫落，大部分CTCs進入外周血后發生凋亡或被吞噬，少數轉移至其他器官發展成為轉移灶或形成局部血栓[8]。外周血腫瘤細胞是導致血栓的重要原因[9]。監測腫瘤細胞的變化成為人們研究的焦點。

大量文獻表明，CTCs與腫瘤的轉移和血栓形成有關[10-11]。病人CTCs水平越高，遠處轉移和復發風險越大，同時高水平循環腫瘤細胞CTCs易形成血栓。卵巢癌病人監測CTCs不僅可幫助臨床醫生發現早期腫瘤，指導臨床化療藥物的應用，還可及時預防復發和腫瘤性血栓[12]。

本研究觀察62例卵巢癌合并VET病人，47例為CTCs陽性，統計分析顯示，CTCs陽性率與上皮性卵巢癌病人的年齡、腫瘤部位、TNM分期及纖維蛋白原無關(P>0.05)；而與CA125、血小板數量及抗凝血酶Ⅲ密切相關，差異有統計學意義(P<0.05)，結果顯示，CTCs與卵巢癌病人血栓的風險正相關。本研究CTCs陽性率與病人的纖維蛋白原無關，而在實際臨床工作中，CTCs陽性率高及纖維蛋白原高的病人更易發生血栓，這可能與臨床樣本量較少有關。因此，CTCs與卵巢癌病人血栓可能性的相關性還需更多大樣本量及多中心的臨床試驗進一步驗證。

綜上所述，CTCs水平與卵巢癌病人栓塞密切相關。監測外周血CTCs有望成為預測卵巢癌病人靜脈栓塞的可靠指標。

[1] Urban RR，He H，Alfonso R，et al.Ovarian cancer outcomes：predictors of early death[J].Gynecol Oncol，2015，140(3)：474-480.

[2] La Vecchia C.Ovarian cancer：epidemiology and risk factors[J].Eur J Cancer Prev，2017，26(1)：55-62.

[3] Zhang P，Wang C，Cheng L，et al.Comparison of HE4，CA125，and ROMA diagnostic accuracy：a prospective and multicenter study for Chinese women with epithelial ovarian cancer[J].Medicine (Baltimore)，2015，94(52)：2402.

[4] Nowak M，Janas L，Stachowiak G，et al.Current clinical application of serum biomarkers to detect ovarian cancer[J].Prz Menopauzalny，2015，14(4)：254-259.

[5] Lianidou ES，Strati A，Markou A.Circulating tumor cells as promising novel biomarkers in solid cancers[J].Crit Rev Clin Lab Sci，2014，51(3)：160-171.

[6] Pearl ML，Dong H，Tulley S，et al.Treatment monitoring of patients with epithelial ovarian cancer using invasive circulating tumor cells (iCTCs)[J].Gynecol Oncol.2015，137(2)：229-238.

[7] Ferreira MM，Ramani VC，Jeffrey SS.Circulating tumor cell technologies[J].Mol Oncol，2016，10(3)：374-394.

[8] Pavlasek J，Kucera E.The importance of circulating tumor cells in the diagnostic and therapeutic process in ovarian cancer[J].Ceska Gynekol，2013，78(4)：342-346.

[9] Liu JF，Kindelberger D，Doyle C，et al.Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) in newly-diagnosed and recurrent ovarian cancer patients[J].Gynecol Oncol，2013，131(2)：352-356.

[10] Huang X，Gao P，Song Y，et al.Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy：a meta-analysis[J].BMC Cancer，2014，14(1)：976.

[11] Zeng L，Liang X，Liu Q，et al.The Predictive value of circulating tumor Ccells in ovarian cancer：a meta analysis[J].Int J Gynecol Cancer，2015，27(6)：1109-1117.

[12] Cui L，Kwong J，Wang CC.Prognostic value of circulating tumor cells and disseminated tumor cells in patients with ovarian cancer：a systematic review and meta-analysis[J].J Ovarian Res，2015，8(1)：38.

(本文編輯薛妮)

山西省婦幼保健院(太原 030001)

杜秀萍，E-mail：13835121498@163.com

信息：張玲，喬翠峰，杜秀萍.上皮性卵巢癌病人外周血循環腫瘤細胞與栓塞的相關性研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(17)：2219-2221.

R737.3 R271

：Bdoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.17.044

：1672-1349(2017)17-2219-03

2017-07-25)