35周歲以下女性囊胚凍融周期移植策略的探討

譚巧，莫美蘭，陳現，胡曉東，黃春宇，陳文娜，曾勇

(深圳市中山泌尿外科醫院生殖中心，深圳 518045)

35周歲以下女性囊胚凍融周期移植策略的探討

譚巧，莫美蘭，陳現，胡曉東，黃春宇，陳文娜，曾勇*

(深圳市中山泌尿外科醫院生殖中心，深圳 518045)

目的探討35周歲以下女性囊胚凍融周期移植策略，以期為保證單個移植周期妊娠率提供參考。方法選擇2015年1月1日至2016年10月1日在本院生殖中心行凍融囊胚移植、年齡<35歲的患者，共1 539個移植周期。根據囊胚移植數目和囊胚等級分為4組：單優質囊胚移植組(單優組)、雙優質囊胚移植組(雙優組)、單非優質囊胚移植組(單非優組)、雙非優質囊胚移植組(雙非優組)。比較4組的臨床妊娠率、種植率、早期流產率、繼續妊娠率和雙胎率。結果雙優組的臨床妊娠率(77.9%)、種植率(61.0%)、繼續妊娠率(90.8%)顯著高于單優組、單非優組、雙非優組(P均<0.05)，早期流產率(8.3%)顯著低于其它3組(P<0.05)，但雙胎率(47.6%)亦顯著高于其它3組(P<0.05)。單優組的臨床妊娠率(51.6%)、繼續妊娠率(80.1%)和早期流產率(18.5%)與雙非優組(分別為49.6%、80.2%、18.9%)比較無顯著差異(P>0.05)，但雙胎率(2.7%)顯著低于雙非優組(27.0%)(P<0.05)。單非優組的雙胎率(1.4%)與單優質組(2.7%)相似，均顯著低于雙優組、雙非優組，但臨床妊娠率(37.6%)亦顯著低于其它3組(P<0.05)。結論35周歲以下女性囊胚凍融移植周期中，可優先選擇移植1個優質凍融囊胚；當無優質凍融囊胚時，可選擇移植2個非優質凍融囊胚以保證一定的單個移植周期妊娠率。

選擇性單胚胎移植； 凍融胚胎移植； 雙胎妊娠率； 臨床妊娠率

(JReprodMed2017，26(9)：891-895)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)作為治療不孕不育的一項重要技術，為越來越多的家庭帶來了福音。然而，近年來，隨著IVF的迅速發展及廣泛應用，雙胎妊娠率亦明顯增加，是自然妊娠的幾十倍[1]。據報道，歐洲2010年IVF妊娠中，雙胎妊娠率為19.2%[2]。美國2013年IVF妊娠分娩中，雙胎分娩占41.1%[3]。雙胎妊娠由于妊娠期、分娩期并發癥多，圍產兒和新生兒死亡率高，給患者的家庭和社會造成嚴重的負擔[4]。因此，如何降低IVF雙胎率逐漸引起生殖領域專家們的重視。

目前降低雙胎妊娠最有效的措施就是進行單胚胎移植(SET)[5]。近十年來，隨著胚胎體外培養系統以及冷凍技術的不斷完善[6]，選擇性單胚胎移植(eSET)尤其是選擇性單囊胚移植(eSBT)日益成為一種趨勢。甚至在一些IVF費用屬于醫療保險報銷范疇的歐洲國家，eSET已成為一項法律規定[7]。而在中國，eSET的執行情況遠不如歐洲國家，可能存在以下幾個方面的原因：(1)eSET可能影響單次移植周期妊娠成功率。雖然有研究表明，SET可增加單次取卵周期的移植周期數，而獲得多個胚胎移植相似的妊娠率[8]。但由于增加了時間以及經濟成本，仍有很多生殖中心以及患者追求單次移植周期妊娠成功率。(2)不孕患者對雙胎妊娠風險的認識不足。(3)當前尚缺乏eSET的標準。

本研究以行凍融囊胚移植的年輕患者(取卵年齡<35歲[9])為研究對象，根據囊胚移植數目以及囊胚等級進行分組，比較單優質囊胚移植、雙優質囊胚移植、單非優質囊胚移植、雙非優質囊胚移植的妊娠結局，探討35周歲以下女性囊胚凍融周期移植策略，為保證一定的單個移植周期妊娠率提供參考。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2015年1月1日至2016年10月1日在本院生殖中心行凍融囊胚移植的1 423例年輕患者的病例資料，共1 539個移植周期。根據囊胚移植數目和囊胚等級，分為單優質囊胚移植組(單優組)、雙優質囊胚移植組(雙優組)、單非優質囊胚移植組(單非優組)、雙非優質囊胚移植組(雙非優組)4組。納入標準：女方取卵年齡<35歲；第5天(D5)或D6凍融囊胚移植。排除標準：同一移植周期混合移植優質囊胚及非優質囊胚。

本研究獲本院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.囊胚培養：IVF或ICSI獲得的胚胎，全部或剩余胚胎行囊胚培養，D5和D6分別觀察囊胚形成情況。

2.囊胚分期及質量分級[10]：1期為囊胚腔<胚胎總體積的1/2；2期為囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2。擴張期囊胚(3～5期)：3期為完全擴張囊胚，囊胚腔完全占據了胚胎的總體積；4期為擴張囊胚，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄；5期為正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶逸出；6期為孵出的囊胚，囊胚全部從透明帶中孵出，脫離透明帶。

囊胚質量分級[10]：(1)內細胞團(ICM)分級：A：細胞數目多，結合緊密；B：細胞數目較少，結合較松散；C：細胞數目極少，難以辨別明顯的ICM結構。(2)滋養外層(TE)分級：A：細胞數目多，囊胚四周均有細胞分布；B：細胞數目較少，上皮細胞較松散；C：上皮細胞層由稀疏的細胞組成。

3.囊胚處理標準：冷凍標準[11-12]：按照本中心常規，≥3期的囊胚且囊胚ICM質量和TE評級至少一個為C以上的囊胚凍存。廢棄標準：1期囊胚或2期囊胚或ICM質量和TE評級為CC者。評分≥3AA、3AB、3BA、3BB的囊胚為優質囊胚。

4.囊胚冷凍和凍融：本中心全部采用玻璃化冷凍方法進行囊胚冷凍及凍融，冷凍及凍融操作按日本加藤公司(KitazatoBiophama，Shizuoka，Japan)玻璃化冷凍、解凍試劑盒說明書進行。移植日當天行囊胚凍融，凍融囊胚行激光輔助孵化后放入Quinns’s Advantage?囊胚培養液中，置于37℃、5%CO2、5%O2培養箱中培養1～2 h，觀察囊胚擴張情況。

5.子宮內膜準備及囊胚移植：自然周期(NC)和人工周期(HRT)準備內膜。(1)NC：根據陰道超聲(TVS)監測，月經天數≥10 d，優勢卵泡直徑≥14 mm，子宮內膜達到7～8 mm以上，排卵后第5天行凍融囊胚移植；(2)HRT：月經第3天起口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜爾，德國)4 mg/d×5 d，根據內膜情況調整用藥劑量及天數。15 d后B超監測子宮內膜厚度7～8 mm以上時，肌肉注射黃體酮60 mg/d至移植日，第6天行凍融囊胚移植。B超引導下行囊胚移植。自移植次日改用黃體酮凝膠(雪諾酮，默克雪蘭諾，瑞士)90 mg/d陰道上藥行黃體支持，直至移植后11 d測血β-HCG。

6.結局判斷及觀察指標：臨床妊娠：移植28 d后陰道B超觀察到孕囊或流產物病理證實。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植囊胚周期數×100%；種植率=B超下見孕囊數/移植囊胚數×100%；早期流產率=妊娠12周期流產的周期數/臨床妊娠周期數×100%；繼續妊娠率=妊娠維持至12周以上周期數/臨床妊娠周期數×100%；雙胎妊娠率=雙胎妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%。

三、統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，對計量資料進行t檢驗，對分類變量資料采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、患者一般情況比較

1 539個凍融囊胚移植周期，其中單優組283個周期、雙優組838個周期、單非優組194個周期、雙非優組224個周期。4組取卵年齡、移植年齡、移植日子宮內膜厚度比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組患者一般情況比較(-±s)

二、各組患者妊娠結局比較

分別對4組患者的臨床妊娠率、種植率、早期流產率、繼續妊娠率、雙胎率進行兩兩比較。雙優組的臨床妊娠率、種植率、繼續妊娠率均顯著高于單優組、單非優組、雙非優組(P均<0.05)，早期流產率則顯著低于其它3組(P<0.05)，但雙胎率亦顯著高于其它3組(P<0.05)。單優組的臨床妊娠率、繼續妊娠率和早期流產率與雙非優組比較無顯著性差異(P>0.05)，但雙胎率顯著低于雙非優組(P<0.05)。單非優組的雙胎率與單優組相似，均顯著低于雙優組、雙非優組(P<0.05)，但臨床妊娠率亦顯著低于其它3組(P<0.05)(表2)。

表2 各組患者妊娠結局比較(%)

注：與其他3組比較，*P<0.05；與雙非優組比較，#P<0.05

討 論

自1978年英國首例試管嬰兒出生，IVF-ET及其衍生技術為越來越多的不孕不育夫婦帶來了希望。為了提高臨床妊娠率及活產率，傳統的IVF通常選擇2～3個胚胎移植。隨著IVF技術的不斷完善，胚胎體外培養環境的不斷優化以及培養體系的完善，胚胎的種植率以及IVF-ET的臨床妊娠率不斷提高，雙胎妊娠率明顯增加并居高不下。而多胎妊娠嚴重威脅著母嬰的健康，并且妊娠胎數與不良妊娠結局有著明顯的相關性。多胎妊娠早產的風險是單胎妊娠的7倍，在32周之前分娩的風險是單胎妊娠的14倍[13]。早產的并發癥使圍產兒死亡風險較單胎增加，其中雙胎妊娠增高4倍，三胎妊娠增高6倍[14]。多胎妊娠增加新生兒和嬰兒近、遠期的患病率，如胎兒早產、低體重兒、極低體重兒、腦癱、學習障礙、語言發展緩慢、行為困難、慢性肺病、發育遲緩和死亡的風險增加。多胎妊娠母體的并發癥較單胎妊娠增加7倍，包括妊娠劇吐、妊娠期糖尿病、高血壓、貧血、出血、剖宮產、產后抑郁癥[15]。既往有剖宮產或肌瘤剔除史的患者，多胎妊娠增加了子宮破裂的風險[4]。早在2002 年，歐洲人類生殖與胚胎學會年會上就已經明確提出：單胎分娩是輔助生殖技術(ART)的首選結局，多胎妊娠應當視為ART的一項并發癥[16]。2003年10月我國《人類輔助生殖技術規范》(衛科教發[2003]176號)中也明確規定“對于多胎妊娠必須實施減胎術，避免雙胎，嚴禁三胎和三胎以上的妊娠分娩”。目前這也成為全世界的一個共識[17]。

臨床上降低多胎妊娠的有效方法有兩種：①施行減胎術；②減少移植胚胎的數目。減胎術是一種被動的補救措施，而減少移植胚胎數目才是一種積極的預防手段。降低雙胎妊娠的最佳手段是SET[5]。早在1999年，就有eSET的提議[18]。而后，這項提議在臨床上逐漸實施，最初在歐洲[19]和加拿大[20]，近年來被越來越多的國家接受及推廣。在一些國家，eSET被制定為一項法律規定[7]。然而，在大部分國家，例如中國、美國，是否全面實施eSET仍存在爭議[21]。其中一個重要原因為擔心eSET可能影響單次移植周期的妊娠結局。自1999年首次提出eSET能有效預防雙胎以來，關于SET與雙囊胚移植(DBT)妊娠結局比較的文章層出不窮。eSET是否在降低雙胎率的同時能維持良好的單次移植周期妊娠結局仍無定論。部分研究認為，eSET能顯著減少多胎妊娠的發生，但妊娠率、活產率并不會因此而降低[22-24]。而梁明明等[25]的研究發現，在凍融周期中，無論是≤35歲或>35歲，單囊胚移植(SBT)的臨床妊娠率、活產率均低于DBT。在本研究中，取卵年齡<35歲的患者，凍融囊胚移植周期中，無論是優質囊胚還是非優質囊胚，SBT的雙胎率顯著低于DBT，但臨床妊娠率也顯著降低。當移植的為優質囊胚時，SBT的早期流產率較DBT增高，繼續妊娠率較DBT降低。提示SET可能影響單次移植周期的臨床妊娠結局。雖然有研究表明，SET可增加單次取卵周期的移植周期數，而獲得與多個胚胎移植相似的妊娠率[8]。但由于增加了時間及經濟成本，所以仍有很多生殖中心以及患者追求單周期妊娠成功率。

缺乏eSET標準可能是阻礙eSET實施的另一個原因。合理的移植策略，對在實現降低雙胎妊娠的基礎上保證一定的單次移植周期妊娠率至關重要。美國生殖醫學會推薦，年齡<35歲的女性患者實施eSET；年齡35～40歲的女性患者，如果存在優質胚胎時，可考慮eSET。本研究發現，年齡<35歲的女性，移植2個優質凍融囊胚，雖然臨床妊娠率和繼續妊娠率分別可達到77.9%和90.8%，早期流產率可下降到8.3%，但雙胎率達到47.6%。移植1個優質凍融囊胚，雖然臨床妊娠率下降，但仍可達到50%以上，維持在一個可接受的水平；而雙胎率下降到2.7%。而當僅移植1個非優質凍融囊胚時，雖然雙胎率可降到1.4%，但臨床妊娠率下降到一個過低的水平(37.6%)。移植2個非優質凍融囊胚，可獲得與單優組相似的臨床妊娠結局，多胎率27.0%，介于移植兩個優質凍融囊胚和單個凍融囊胚之間。

綜上所述，在年齡<35歲的女性凍融囊胚移植周期中，若存在優質囊胚，可優先選擇移植單個優質凍融囊胚。若無優質凍融囊胚，為了保證一定的單次移植周期移植妊娠率，可考慮移植2個非優質凍融囊胚。

[1] Sharara FI，Abdo G.Incidence of monozygotic twins in blastocyst and cleavage stage assisted reproductive technology cycles[J].Fertil steril，2010，93：642-645.

[2] deMouzon J，Goossens V，Bhattacharya S，et al.Assisted reproductive technology in Europe，2006：results generated from European registers by ESHRE[J].Hum Reprod，2010，25：1851-1862.

[3] Sunderam S，Kissin DM，Crawford S，et al.Assisted reproductive technology surveillance--United States，2010[J].MMWR Surveill Summ，2013，62：1-24.

[4] 胡琳莉，黃國寧，孫海翔，等.多胎妊娠減胎術操作規范(2016)[J].生殖醫學雜志，2017，26：193-198.

[5] Sullivan EA，Wang YA，Hayward I，et al.Single embryo transfer reduces the risk of perinatal mortality，a population study[J].Hum Reprod，2012，27：3609-3615.

[6] Roque M，Valle M，Guimaraes F，et al.Freeze-all policy：fresh vs.frozen-thawed embryo transfer[J].Fertil Steril，2015，103：1190-1193.

[7] Maheshwari A，Griffiths S，Bhattacharya S.Global variations in the uptake of single embryo transfer[J].Hum Reprod Update，2011，17：107-120.

[8] van Loendersloot LL，Moolenaar LM，van Wely M，et al.Cost-effectiveness of single versus double embryo transfer in IVF in relation to female age[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2017，214：25-30.

[9] Sahmay S，Oncul M，Tuten A，et al.Anti-mullerian hormone levels as a predictor of the pregnancy rate in women of advanced reproductive age[J].J Assist Reprod Genet，2014，31：1469-1474.

[10] Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome：towards a single blastocyst transfer[J].Fertil Steril，2000，73：1155-1158.

[11] Chatzimeletiou K，Morrison EE，Panagiotidis Y，et al.Cytoskeletal analysis of human blastocysts by confocal laser scanning microscopy following vitrification[J].Hum Reprod，2012，27：106-113.

[12] Du QY，Wang EY，Huang Y，et al.Blastocoele expansion degree predicts live birth after single blastocyst transfer for fresh and vitrified/warmed single blastocyst transfer cycles[J].Fertil Steril，2016，105：910-919.

[13] Martin JA，Hamilton BE，Ventura SJ，et al.Births：final data for 2010[J].Natl Vital Stat Rep，2012，61：1-72.

[14] Roberts SA，McGowan L，Mark Hirst W，et al.Reducing the incidence of twins from IVF treatments：predictive modelling from a retrospective cohort[J].Hum Reprod，2011，26：569-575.

[15] 來天嬌，郭藝紅.多胎妊娠減胎術倫理爭議[J].生殖醫學雜志，2017，26：219-223.

[16] ESHRE Task Force on Ethics and Law.6.Ethical issues related to multiple pregnancies in medically assisted procreation[J].Hum Reprod，2003，18：1976-1979.

[17] Qin JB，Wang H，Sheng X，et al.Assisted reproductive technology and risk of adverse obstetric outcomes in dichorionic twin pregnancies：a systematic review and meta-analysis[J].Fertil Steril，2016，105：1180-1192.

[18] Vilska S，Tiitinen A，Hyden-Granskog C，et al.Elective transfer of one embryo results in an acceptable pregnancy rate and eliminates the risk of multiple birth[J].Hum Reprod，1999，14：2392-2395.

[19] Ozturk O，Bhattacharya S，Templeton A.Avoiding multiple pregnancies in ART：evaluation and implementation of new strategies[J].Hum Reprod，2001，16：1319-1321.

[20] Bissonnette F，Phillips SJ，Gunby J，et al.Working to eliminate multiple pregnancies：a success story in Quebec[J/OL].Reprod Biomed Online，2011，23：500-504.

[21] Adashi EY，Gleicher N.Is a blanket elective single embryo transfer policy defensible?[J].Rambam Maimonides Med J，2017，8：2.

[22] Tannus S，Son WY，Dahan MH.Elective single blastocyst transfer in advanced maternal age[J].J Assist Reprod Genet，2017，34：741-748.

[23] Mancuso AC，Boulet SL，Duran E，et al.Elective single embryo transfer in women less than age 38 years reduces multiple birth rates，but not live birth rates，in United States fertility clinics[J].Fertil Steril，2016，106：1107-1114.

[24] 陳攀宇，方叢，賈磊，等.復蘇周期D5單囊胚移植與雙囊胚移植對妊娠結局的影響[J].生殖醫學雜志，2016，25：1049-1053.

[25] 梁明明，唐永梅，韋立紅,等.凍融移植周期中單、雙囊胚及卵裂期雙胚胎移植結局的臨床分析[J].中國計劃生育學雜志，2016，24：682-686.

[編輯：侯麗]

Thestrategyoffrozen-thawedblastocysttransferinwomenlessthan35yearsold

TAN Qiao，MO Mei-lan，CHEN Xian，HU Xiao-dong，HUANG Chun-yu，CHEN Wen-na，ZENG Yong*

FertilityCenter，ShenzhenZhongshanUrologyHospital，Shenzhen518045

Objective： To investigate the strategy of frozen-thawed blastocyst transfer in women less than 35 years old，in order to provide guideline for maintaining a certain pregnancy rate of single transfer cycle.

Methods： The young women less than 35 years old came to the reproductive center of Shenzhen Zhongshan Urology Hospital from Jan.1 2015 to Oct.1 2016 were enrolled in this study.The data of 1 539 frozen-thawed blastocyst transfer cycles were analyzed.The transfer cycles were divided into four groups according to the quantity and quality of blastocyst：single high-quality blastocyst group，double high-quality blastocysts group，single poor-quality blastocyst group，and double poor-quality blastocysts group.The clinical pregnancy rate，implantation rate，early miscarriage rate，ongoing pregnancy rate and twin pregnancy rate were compared among the four groups respectively.

Results： The clinical pregnancy rate (77.9%)，implantation rate (61.0%)，ongoing pregnancy rate (90.8%) in double high-quality group were significantly higher than those in single high-quality group，single poor-quality group and double poor-quality group (P<0.05).The early miscarriage rate (8.3%) was significantly lower than those in other three groups，while the twin pregnancy rate (47.6%) was significantly higher than those in other three groups (P<0.05).The clinical pregnancy rate (51.6% vs.49.6%)，ongoing pregnancy rate (80.1% vs.80.2%)，early miscarriage rate (18.5% vs.18.9%) in single high-quality group were not significantly different to those in double poor-quality group (P>0.05)，while the twin pregnancy rate was significantly lower than that in double poor-quality group (2.7% vs.27.0%，P<0.05).The twin pregnancy rate in single poor-quality group (1.4%) was similar to single high-quality group (2.7%)，but it was significantly lower than double high-quality group and double poor-quality group，while the pregnancy rate (37.6%) was yet significantly lower than that in other three groups (P<0.05).

Conclusions： Single high-quality frozen-thawed blastocyst can be preferred to transplant for women less than age 35 years.Two poor-quality frozen-thawed blastocysts may be chosen to transfer in order to improve the pregnancy rate of single transfer cycle，if there is no high-quality frozen-thawed blastocyst available.

Selected single-blastocyst transfer； Frozen-thawed cycles； Twin pregnancy rate； Clinical pregnancy rate

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.09.008

2017-05-09；

2017-06-15

深圳市科創委基礎研究項目(JCYJ20160427113514229)

譚巧，女，湖南衡陽人，碩士，主治醫師，生殖醫學專業.(*

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