體外受精-胚胎移植中與生化妊娠相關因素的分析

龔衍，趙梓琳，劉偉信，曾玖芝，葉飛，賴薇

(四川省婦幼保健院生殖醫學中心，成都 610045)

體外受精-胚胎移植中與生化妊娠相關因素的分析

龔衍*，趙梓琳，劉偉信，曾玖芝，葉飛，賴薇

(四川省婦幼保健院生殖醫學中心，成都 610045)

目的分析體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中導致生化妊娠的相關因素。方法回顧性分析2014年1月至2016年12月在我院行IVF/ICSI-ET助孕后生化妊娠的68個周期，以同期正常宮內妊娠的307個周期為對照組，比較兩組患者的一般情況及助孕相關指標，采用Logistic回歸分析篩選生化妊娠的影響因素。結果兩組患者的一般情況及助孕相關指標均無顯著性差異(P>0.05)。多因素Logistic回歸分析發現女方年齡、亞臨床甲狀腺功能減退(SCH)及受精方式是生化妊娠的影響因素(P<0.05)，且年齡偏大、合并SCH未治療或治療后仍不正常、ICSI操作的患者更易發生生化妊娠。結論開始IVF-ET治療前應重視甲狀腺功能檢查，及時糾正SCH，嚴格掌握ICSI指征及規范操作，重視高齡女性患者，盡量改善其卵母細胞質量等有助于降低臨床上生化妊娠發生率。

體外受精-胚胎移植； 生化妊娠； 年齡； 亞臨床甲減； 卵胞漿內單精子顯微注射

(JReprodMed2017，26(9)：896-901)

體外受精-胚胎移植技術(IVF-ET)在臨床開展接近40年，卵胞漿內單精子注射(ICSI)作為常規IVF的衍生技術，適用于嚴重男性因素不孕及常規IVF受精失敗的患者，在臨床開展也近30年，IVF/ICSI妊娠率逐漸提高，但仍徘徊在50%左右，其中部分為生化妊娠[1]。生化妊娠指胚胎已經著床，但由于某種原因妊娠終止，β-HCG只是一過性升高[2]。生化妊娠在IVF/ICSI中的發生率約為12%～30%[3]，導致助孕失敗，增加患者的經濟負擔和心理壓力，迄今為止，其發生機制尚不清楚。本研究回顧性分析我院近3年發生的68例生化妊娠的臨床資料，旨在探討其發生的相關因素，為臨床中采取針對性措施提供參考，最終改善IVF/ICSI的助孕結局。

資料與方法

一、研究對象和分組

回顧性分析2014年1月至2016年12月在我院生殖醫學中心行IVF/ICSI-ET助孕治療患者的臨床資料。納入新鮮胚胎移植后生化妊娠和臨床妊娠的周期，排除合并子宮畸形、子宮內膜異位癥、夫婦至少一方染色體異常的周期，共納入429個周期，其中生化妊娠68個周期，臨床妊娠361個周期，生化妊娠發生率為15.85%(68/429)。臨床妊娠中正常宮內妊娠307個周期，以正常宮內妊娠者為對照組。

生化妊娠診斷標準為：β-HCG超過參考值但升高不明顯或下降，或移植后28 d陰道B超未見孕囊[4]。正常宮內妊娠診斷標準：移植后28 d陰道B超見子宮內孕囊、胚芽及胎心搏動。

二、研究方法

1.控制性超排卵方案：根據患者年齡、卵巢儲備功能等選擇促排卵方案，卵巢儲備功能正?；颊咭话悴捎么傩韵偌に蒯尫偶に丶觿?GnRH-a)長方案；卵巢儲備功能下降、多囊卵巢綜合征患者一般采用GnRH拮抗劑(GnRH-ant)方案。給予果納芬(默克雪蘭諾，德國)150～225 U啟動，根據卵泡生長、激素水平情況調整促性腺激素(Gn)的種類及用量。當1～2個卵泡直徑達到18 mm后注射艾澤(默克雪蘭諾，德國)250 μg，36.5 h后B超引導下取卵。

2.IVF、胚胎培養：取卵后短時授精或ICSI授精，取卵后2.5～7.5 h拆除顆粒細胞以觀察卵母細胞形態并評估其成熟度。將胞質顆粒細小、分布均勻，無發黑，胞漿內無壞死區、空泡、折光小體、滑面內質網等內容物，第一極體光滑、完整，呈圓形或橢圓形，透明帶及卵周隙正常的MⅡ卵定義為正常形態卵母細胞，反之為異常形態卵母細胞[5]。1個周期的卵母細胞中只要有1個卵母細胞形態明顯異常即定義為卵母細胞形態異常周期。

受精后20～22 h觀察受精情況，雙原核(2PN)為正常受精。受精后第2、3天觀察卵裂、胚胎情況。根據形態學參數將第3天(D3)胚胎分為4級。Ⅰ級：卵裂球大小均勻，形態規則，透明帶完整，胞質均勻清晰，沒有顆?，F象，碎片0～5%；Ⅱ級：卵裂球大小略不均勻，形態略不規則，胞質可有顆?，F象，碎片10%～20%；Ⅲ級：細胞大小明顯不均勻，形態明顯不規則，胞質見顆粒現象，碎片21%～50%；IV級：細胞大小嚴重不均勻，胞質可有嚴重顆?，F象，碎片>50%。優質胚胎定義：Ⅰ、Ⅱ級，卵裂球>6個。Ⅰ～Ⅲ級胚胎為可移植胚胎。優胚率=優質胚胎數/可移植胚胎數×100%。移植胚胎中至少有1個優胚的周期為有優質胚胎的周期。

3.ET、黃體支持及隨訪：取卵后3 d腹部超聲引導下移植1～3個胚胎。取卵日肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)60 mg/d進行黃體支持，胚胎移植日口服地屈孕酮(上海雅培)20 mg/d。移植后14 d查血清β-HCG，確診生化妊娠者移植28 d行B超檢查。

4.觀察指標：統計每個周期的一般情況：雙方年齡、不孕因素、女方體重指數(BMI)、自然流產史、是否合并亞臨床甲狀腺功能減退(SCH)、男方精子DNA碎片率。統計IVF過程中：HCG日孕酮(P)水平、卵母細胞形態、受精方式、優胚率、移植胚胎數、移植胚胎中是否有優胚、子宮內膜厚度等。

男方IVF前常規按照WHO第五版精液分析標準進行精液檢查，精子DNA碎片率>15%為升高。女方IVF術前常規檢查甲狀腺功能，如異常即給予相應治療。SCH的診斷標準：參考美國甲狀腺學會推薦的妊娠早期診斷標準，促甲狀腺激素(TSH)>2.5 mU/L，游離甲狀腺素(FT4)、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)正常。治療：口服左甲狀腺素鈉片(柏林，德國)，將TSH控制在2.5 mU/L以下[6]。ET后首次驗孕日查甲狀腺功能，如TSH<2.5 mU/L為治療后正常，否則為治療后仍不正常，未遵醫囑服藥者為未治療。HCG日P值<9.51 nmol/L為正常；如HCG日P≥9.51 nmol/L或≥4.76 nmol/L持續超過3 d，HCG日內膜<8 mm則取消移植，全胚冷凍。

三、統計學方法

結 果

一、一般情況比較

生化妊娠組68個周期，女方年齡22～45歲，男方年齡23～58歲；正常宮內孕組307個周期，女方年齡20～43歲，男方年齡24～46歲。兩組患者一般情況比較無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、助孕相關指標比較

生化妊娠組移植日內膜厚度為8～18 mm，卵母細胞形態異常的周期1個；正常宮內孕組移植日內膜厚度為6～20 mm，卵母細胞形態異常的周期2個。兩組患者助孕治療中相關指標比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、單因素Logistic回歸分析

以組別為結果變量，其余變量為自變量進行賦值(具體見表3)，并分別進行單變量Logistic回歸分析，結果見表4。由表4可知，在單因素分析中，兩組差別有統計學意義的影響因素包括：女方年齡、精子DNA碎片率、SCH、受精方式。

四、多因素Logistic回歸分析

將女方年齡、SCH、男方精子DNA碎片率、受精方式作為多因素Logistic回歸分析的候選變量，采用后退法對變量進行篩選，最后進入模型的變量和參數見表5。由表5可知，除男方DNA碎片率外，女方年齡、SCH、受精方式均P<0.05，因此女方年齡、SCH、受精方式與生化妊娠有關，結合回歸分析前對各變量的賦值及系數均為負值，分析得出年齡偏大、合并SCH未治療或治療后仍不正常、ICSI受精患者更易發生生化妊娠。

表1 兩組患者一般情況比較 [(-±s)，n (%)]

表2 兩組患者助孕治療相關指標比較 [(-±s)，n (%)]

表3 研究變量的定義及賦值

表4 生化妊娠相關因素的單因素Logistic分析結果

注：*P<0.05

表5 與生化妊娠相關因素的多因素Logistic回歸分析

討 論

生化妊娠是早期妊娠丟失(FTPL)的一種特殊類型，在自然受孕的婦女中發生率約為30%，在IVF/ICSI中發生率約為12%～30%[3]，本研究中生化妊娠在IVF/ICSI中的發生率為15.85%，與文獻[3]報道相符。生化妊娠發生機制尚不完全明確，可能與胚胎染色體異常(主要為非整倍體)、母體內分泌、免疫等異常，精子質量異常，環境中有毒、有害物質等有關[3]。對這些因素進行相關分析的報道不多，尤其對胚胎染色體、環境因素的檢測相對困難，因此我們分析了臨床常見的一些指標：患者一般情況、病史、IVF/ICSI過程中的相關數據，發現女方年齡、SCH、ICSI受精是生化妊娠的危險因素。

一、重視女性高齡患者

女性年齡越大，卵母細胞線粒體、紡錘體老化和同源染色體不分離、姐妹染色單體過早分離越容易發生，卵母細胞非整倍體發生率增加、胚胎質量下降，進而導致妊娠率下降、生化妊娠率增加[7]。本研究結果顯示高齡是導致生化妊娠的因素之一，因此重視高齡患者，促排卵前盡量改善卵母細胞質量有望降低生化妊娠率。女性年齡增加，卵母細胞質量下降、形態學可能發生異常，出現胞漿顆?；?、極體碎裂、卵周隙增大等，研究顯示生化妊娠比正常妊娠卵母細胞形態異常所占的比例增加[5]。因本研究樣本量較小，生化妊娠組卵母細胞異常周期僅1個，正常宮內孕組僅2個，沒有進行統計學分析，有待今后擴大樣本量后再進行研究。

二、IVF前重視甲狀腺功能檢查并糾正SCH可減少生化妊娠

本研究結果顯示SCH是生化妊娠的危險因素。不育婦女中SCH的發生率約4.0%～15.4%[8]。甲狀腺素在維持人類正常生殖功能中發揮重要作用：TSH及其受體和甲狀腺激素受體在人卵巢顆粒細胞和卵母細胞均有表達，協同調節顆粒細胞增殖與凋亡、P分泌、滋養層細胞侵入等[8-9]。SCH患者體內性激素結合球蛋白(SHBG)減少，游離睪酮與雌二醇(E2)增加，抑制FSH分泌，直接降低顆粒細胞對FSH的反應性，影響卵母細胞的發育；升高的TSH通過對垂體-甲狀腺軸的負反饋，使促甲狀腺素釋放激素(TRH)升高，多巴胺分泌減少，引起高泌乳素血癥，導致排卵障礙、黃體功能不足[10]；甲狀腺素協同EGF的作用下降，影響胚胎著床及正常妊娠的維持[11]；降鈣素水平降低，調節子宮內膜細胞分化和胚泡發育的作用下降，影響胚胎著床，導致生化妊娠。

IVF過程中患者體內E2、SHBG、P水平升高，對于TSH及甲狀腺激素水平的要求可能與自然妊娠不完全一致。研究發現IVF/ICSI周期中TSH>2.5 mU/L時，患者的流產率升高，活產率、種植率降低，TSH>4.2 mU/L時流產率高達24.24%，生化妊娠率高達11.80%[1]。因此，2012年美國內分泌協會臨床實踐指南建議，有SCH或不孕癥病史、年齡超過30歲、甲狀腺抗體陽性等情況的婦女，孕前最好控制TSH水平在2.5 mU/L以內[6]。我們參照該指南給予SCH患者左甲狀腺素片治療，結果正常宮內妊娠組比生化妊娠組TSH<2.5 mU/L的周期所占比例更高，統計分析也顯示SCH未治療或治療后未正常是生化妊娠的危險因素，與文獻[12]報道一致。目前國內尚沒有指南規定IVF患者孕前SCH的診斷標準、治療目標等，有必要就此深入研究。

三、嚴格掌握ICSI指針有望減少生化妊娠

目前，ICSI對胚胎著床率、生化妊娠率是否有影響還存在爭議[13-14]。本研究數據分析顯示ICSI是生化妊娠的危險因素。ICSI導致生化妊娠的可能原因為：ICSI適應證包括嚴重少、弱、畸形精子癥，附睪、睪丸取精，前次IVF受精失敗者，這部分患者本身可能存在嚴重的精子或卵母細胞缺陷，導致胚胎質量差、發育停滯；ICSI過程避開了正常受精時精卵融合后觸發的卵母細胞皮質反應，但可能損傷卵母細胞的微管微絲系統，影響受精卵及胚胎發育[14]。男性年齡較大時精子DNA碎片率升高，精子染色質結構穩定性降低，導致胚胎質量下降甚至發育停滯，DNA碎片率≥30%時流產率增加[15]。我們的數據顯示兩組患者不孕因素構成比接近，且與生化妊娠沒有相關性；男性年齡、DNA碎片率亦與生化妊娠沒有相關性。因此，生化妊娠可能與ICSI適應癥無關，而與ICSI操作本身對卵母細胞、胚胎質量的影響有關，因此嚴格掌握ICSI指征可能會減少生化妊娠。但因本研究樣本量較小、生化妊娠的影響因素又眾多，后續還需全面深入地研究加以驗證。

成功妊娠需要優質的胚胎和容受性正常的子宮內膜。生化妊娠與優胚率、是否移植優質胚胎的相關性尚沒有定論[4]。本研究中優胚率、是否移植優質胚胎與生化妊娠沒有明顯相關性。可能與以下因素有關：采用形態學標準評分胚胎，不能完全反映胚胎染色體是否正常及預測胚胎發育潛能，形態學表現為優質胚胎的染色體異常發生率仍高達32.8%[16]；即使對胚胎進行植入前非整倍體篩查(PGS)，選擇染色體正常的胚胎移植，也不能降低生化妊娠率[17]，提示胚胎染色體異常不是生化妊娠的主要原因。目前我中心尚未進行單胚胎移植，故將移植胚胎中至少有1個優質胚胎的周期作為參數之一，開展單胚胎移植后可以直接比較“優質胚胎”周期和“非優質胚胎”周期。有研究還發現HCG日內膜厚度<9 mm、P≥9.51 nmol/L者生化妊娠發生率升高[18]，但也有研究否定這種相關性[5]。本研究顯示兩者均與生化妊娠無關，可能因為按照我中心取消移植的標準，這些患者大部分全胚冷凍，因此減少了可能發生的生化妊娠。有研究報道既往合并自然流產史的患者發生生化妊娠的概率更高[4]，本研究結果未顯示兩者的相關性，這可能與排除合并子宮畸形的周期，IVF前進行充分檢查和治療，根除了既往導致自然流產的部分因素有關。另外，IVF中首選優質胚胎移植，充分的黃體支持和密切隨訪也大大削減了可能導致自然流產的因素。

綜上所述，IVF治療前重視甲狀腺功能檢查及治療，嚴格掌握ICSI指征，尤其注意高齡患者，盡量改善其卵母細胞質量有助于減少生化妊娠。導致IVF中生化妊娠的原因十分復雜，每個生殖中心患者的特點、預處理措施及促排卵方案、實驗室培養條件均不同，需要結合自己的實際情況尋找最可能的原因并給予針對性干預。

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[編輯：肖曉輝]

AnalysisofinfluencingfactorsofbiochemicalpregnancyafterIVF/ICSI

GONG Yan*，ZHAO Zi-lin，LIU Wei-xin，ZENG Jiu-zhi，YE Fei，LAI Wei

CenterofReproductiveMedicine，SichuanMaternalandChildren'sHospital，Chengdu610045

Objective： To analyze the influencing factors of the biochemical pregnancy after IVF/ICSI-ET.

Methods： The data of 68 biochemical pregnancies and 307 intrauterine pregnancies in IVF/ICSI-ET cycles from January 2014 to December 2016 were retrospectively analyzed.The general conditions and the assisted pregnancy related indexes of the two groups were compared.The influencing factors of biochemical pregnancy were screened by univariate regression logistic analysis.

Results： There was no significant difference in general conditions and the assisted pregnancy related indexes between the two groups (P>0.05).Multivariate logistic regression analysis showed that female age，subclinical hypothyroidism (SCH) and fertilization method were the influencing factors of biochemical pregnancy (P<0.05).The elder women with SCH who did not be treated or were still abnormal after treatment were more prone to biochemical pregnancy after ICSI treatment.

Conclusions： The thyroid function tests should be paid attention to，SCI should be timely corrected before IVF/ICSI-ET，and ICSI indications should be strictly controlled.The elder patients need more attention to improve the quality of oocytes.All the measures will help reduce the incidence of biochemical pregnancy.

IVF-ET； Biochemical pregnancy； Age； Subclinical hypothyroidism； ICSI

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.09.009

2017-02-14；

2017-04-07

四川省衛計委課題(16PJ386)

龔衍，女，漢族，四川人，碩士，副主任醫師，生殖醫學專業.(*

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