顆粒蛋白前體在高脂飲食誘導的肥胖PCOS大鼠卵巢中的表達

李賽姣，周丹妮，李維，尹太郎，楊菁

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，湖北省輔助生育與胚胎發育醫學臨床研究中心，武漢 430060)

·實驗研究·

顆粒蛋白前體在高脂飲食誘導的肥胖PCOS大鼠卵巢中的表達

李賽姣，周丹妮，李維，尹太郎，楊菁*

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，湖北省輔助生育與胚胎發育醫學臨床研究中心，武漢 430060)

目的研究顆粒蛋白前體(PGRN)在肥胖PCOS大鼠卵巢中的表達情況，初步探討PGRN在PCOS發病中的作用。方法選擇SPF級23日齡SD雌性大鼠38只，使用隨機數字表隨機分為3組：正常對照組(n=8)、PCOS組(DHEA組，n=15)及肥胖PCOS組(DHEA+HFD組，n=15)。采用脫氫表雄酮聯合高脂飼料(DHEA+HFD)誘導肥胖PCOS大鼠。HE染色光鏡下觀察PCOS大鼠卵巢的病理結構改變。酶聯免疫吸附法測定血清睪酮(T)、雌二醇(E2)及空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)含量等，比較各組間的水平差異。采用免疫組織化學法檢測各組卵巢PGRN的表達水平及分布情況。結果造模結束時，DHEA+HFD組體重顯著高于對照組(P<0.01)及DHEA組(P<0.05)。DHEA組及DHEA+HFD組的FINS、穩態模型評估的胰島素抵抗指數(HOMA-IR)均顯著高于對照組(P<0.05)。DHEA組及DHEA+HFD組的睪酮(T)、FSH水平均顯著升高(P<0.01)。DHEA組及DHEA+HFD組卵巢組織光鏡下均表現出典型的多囊樣改變。免疫組化結果顯示各組大鼠卵巢中均可見PGRN蛋白表達，主要分布于卵泡的顆粒細胞層及黃體；DHEA組PGRN表達水平顯著高于對照組(P<0.01)，DHEA+HFD組PGRN表達水平顯著高于DHEA組及對照組(P<0.01)。結論PGRN在卵巢顆粒細胞層有表達。其在PCOS大鼠和肥胖PCOS大鼠卵巢組織中的差異性表達，提示PGRN可能通過作用于局部卵泡微環境，參與PCOS肥胖及慢性代謝性炎癥的發生。

多囊卵巢綜合征； 顆粒細胞； 顆粒蛋白前體

(JReprodMed2017，26(9)：921-926)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女最常見的內分泌和代謝性紊亂的慢性疾病，是導致女性不孕的主要原因之一。PCOS發病率在生育期婦女中高達5%～10%[1-2]，是一種高度異質、病因復雜的內分泌、代謝紊亂性疾病，常伴隨肥胖、代謝紊亂及心血管疾病特征[3-4]，其發病機制不明，目前慢性炎癥學說已成為研究的熱點。但PCOS代謝性炎癥形成的機制未明，炎癥信號通路活性改變可能是PCOS發病機制之一。

顆粒蛋白前體(PGRN)是參與人體炎癥和免疫反應的一種重要分泌蛋白。近年國內外多項研究發現PGRN是一種重要的調控葡萄糖代謝和胰島素敏感性的炎癥因子，與代謝綜合征、胰島素抵抗(IR)以及炎癥反應密切相關[5-6，7]。研究顯示，PGRN對肥胖和IR的糖尿病具有促炎效果，被發現是一個關鍵的脂肪因子，可以調節高脂飲食誘導的IR[5]。PGRN在女性子宮腺上皮及卵巢濾泡上皮細胞中均有表達[8]。新的研究證實，PCOS患者與年齡、體重匹配的對照組相比PGRN表達水平顯著升高，PGRN與血清高密度脂蛋白膽固醇HDL-C水平顯著相關，提示PGRN可能是PCOS患者心血管疾病的生物標記物[9]。然而PGRN在PCOS患者卵巢中表達的研究目前仍為空白。考慮到肥胖是PCOS婦女常見的表現，約35%～50%的患者有肥胖[10]，本實驗中以脫氫表雄酮(DHEA)聯合高脂飼料(HFD)誘導肥胖PCOS大鼠，在成功建模的基礎上，檢測PGRN表達水平；并進一步解釋PCOS的病理生理改變，初步探討PCOS肥胖大鼠卵巢上PGRN的表達差異。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物：SPF級21日齡SD雌性大鼠38只，購自武漢大學實驗動物中心。自21 d齡開始斷奶，標準顆粒飼料喂養，自由進食、飲水適應性喂養2日后，進行隨機分組。

2.藥物及試劑：兔抗大鼠PGRN單克隆抗體購自美國Abcam公司；DHEA購自湖北芳通藥業；免疫組化染色試劑盒、甲醛及多聚賴氨酸處理的硅化玻片均購自武漢博士德公司；胰島素放免法試劑盒(批內變異系數<10%；批間變異系數<15%)、性激素酶聯免疫分析試劑盒為美國R&D公司產品；苯巴比妥鈉購自北京索萊寶公司；高脂飼料購自上海斯萊克實驗動物公司，成分為：54.2%標準飲食，16.8%豬油，15%蔗糖，9%酪蛋白，1%無機物，1%維生素和3%麥芽糊精。其他試劑均為國產分析純。

二、方法

1.動物分組及建模：按隨機數字表將23日齡大鼠38只隨機分為3組：正常對照組、PCOS組及肥胖PCOS組。

對照組(n=8)：給予標準飲食(52%碳水化合物，22.1%蛋白質，9.2%水，5.28%脂肪，4.12%纖維素，4.22%礦物鹽)和注射用蓖麻油0.2 ml每日皮下注射。PCOS組(DHEA組，n=15)：給予標準飲食，每日給予皮下注射DHEA 6 mg/100 g/d的劑量(溶于0.2 ml注射用蓖麻油)，連續3周。肥胖PCOS組(DHEA+HFD組，n=15)：每日給予皮下注射DHEA 6 mg/100 g/d的劑量(溶于0.2 ml注射用蓖麻油)，連續3周，同時給予高脂飲食。每周稱量大鼠體重，實驗藥物劑量進行相應調整。3周以后，隔夜禁食的大鼠用苯巴比妥鈉(120 mg/kg)皮下注射麻醉，取大鼠下腔靜脈血，3 000 r/min，離心3 min，收集血清，-20℃保存測量血液樣本。切除雙側卵巢，小心修剪脂肪組織，4%多聚甲醛固定作光鏡HE染色。

2.血清性激素及胰島素的檢測：血清激素水平的測定采用化學免疫發光法，包括血清空腹血糖(FPS)、雌二醇(E2)、睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)及黃體生成素(LH)，空腹胰島素(FINS)水平測定采用放免法。穩態模型評估的胰島素抵抗指數(HOMA-IR)計算公式為FINS(mU/L)×FBG(mmol/L)/22.5。

3.光鏡標本制作：取卵巢組織迅速置入10%中性甲醛中固定，以卵巢最大平面為待檢測面，進行常規石蠟包埋，連續切片(4 μm厚)，粘貼于涂有多聚賴氨酸的清潔載玻片上，按照每隔20張取1張的方法，制備切片。烤片后，室溫無塵保存，切片用于HE染色觀察卵巢的病理結構。

4.卵巢PGRN蛋白的表達檢測：取出卵巢組織固定于10%的甲醛溶液中。將石蠟包埋標本制成常規切片，采用免疫組織化學SABC法。操作按試劑盒說明進行。切片脫蠟至水后，95℃水浴中抗原修復，加入1：200稀釋的一抗。依次加二抗、三抗作用，DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片。以已知陽性片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

三、統計學分析

結 果

一、各組體重增長情況

各組大鼠實驗前體重比較無顯著性差異(P>0.05)。造模結束時，DHEA組大鼠體重顯著高于對照組(P<0.05)，DHEA+HFD組大鼠體重顯著高于對照組(P<0.01)及DHEA組(P<0.05)(圖1)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與DHEA組比較，# P<0.05圖1 三組大鼠體重增長曲線圖

二、各組FPS、胰島素檢測結果比較

與對照組相比，DHEA組和DHEA+HFD組的FINS水平、HOMA-IR均顯著升高(P<0.05)，DHEA組與DHEA+HFD組間則無顯著性差異(P>0.05)；3組的FPS比較無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

三、血清激素水平比較

與對照組相比，DHEA組及DHEA+HFD組的T、FSH水平均顯著升高(P<0.01)，證實經過DHEA處理的大鼠均存在高雄激素血癥。而各組的E2、LH水平均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1 三組大鼠血清FINS、FPS水平及HOMA-IR比較 (-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05

表2 三組大鼠血清性激素濃度比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.01

四、卵巢病理結構光鏡觀察情況

光學顯微鏡觀察顯示，對照組(圖2A)中顯示正常卵巢結構，可見不同發育階段的卵泡及黃體，未見明顯囊性擴張卵泡，卵泡有8～9層的顆粒細胞，明顯多于DHEA組及DHEA+HFD組。DHEA組及DHEA+HFD組(圖2B、C)中卵巢均較對照組增大，光鏡下可見卵巢多個囊性擴張卵泡，顆粒細胞層厚約2～3層。

五、PGRN在卵巢中的表達

免疫組化法分析PGRN在卵巢中的定位及表達。PGRN陽性表達主要為棕黃色顆粒沉著。由圖3可見，PGRN主要分布于卵泡的顆粒細胞層及黃體。PGRN蛋白在各組大鼠卵巢始基卵泡、竇前卵泡及竇狀卵泡的卵母細胞、顆粒細胞上均有強陽性表達，各級別卵泡膜細胞層均為弱陽性表達。

A：對照組；B：DHEA組；C：DHEA+HFD組圖2 三組大鼠卵巢組織形態學分析(HE染色，×100)

A：對照組；B：DHEA組；C：DHEA+HFD組圖3 三組大鼠卵巢組織PGRN蛋白的表達(免疫組化染色，×100)

統計學分析各組卵泡顆粒細胞層及膜細胞層PGRN表達差異：各組膜細胞層中PGRN表達水平比較無顯著性差異(P>0.05)；顆粒細胞層中，DHEA組PGRN表達水平顯著高于對照組(P<0.01)，DHEA+HFD組PGRN表達水平顯著高于DHEA組及對照組(P<0.01)(表3)。

表3 三組大鼠卵巢組織PGRN表達水平比較(以平均光密度表示)(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與DHEA組比較，#P<0.01

討 論

PGRN由于其在腫瘤的發生發展過程中的關鍵作用，目前已成為多種腫瘤研究的熱點，而炎癥方面的研究剛剛起步。目前的研究證實PGRN與多種脂肪炎性因子密切相關，近年來，Matsubara等[5]研究表明PGRN是一種關鍵的脂肪因子，能夠調節高脂飲食誘導的IR。Youn等[11]的研究發現人血清中的PGRN水平與炎癥標記物C反應蛋白(CRP)以及糖化血紅蛋白相關，且與單核細胞趨化因子1(MCP-1)類似，能參與到脂肪組織巨噬細胞的浸潤，提示PGRN是一種新的慢性炎性反應標志物。

肥胖是PCOS婦女常見的表現[12]，脂肪細胞能夠分泌多種脂肪炎性因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等影響全身的代謝狀態，從而導致系統性的、代謝激活的慢性低度炎癥，稱之為代謝性炎癥。這種炎癥狀態會影響能量儲存及轉化的代謝器官如肝臟、脂肪、骨骼肌等，導致IR等系統性代謝紊亂[10]。目前越來越多的證據支持PCOS是一種慢性炎性疾病，PCOS患者血清中炎癥因子如IL-6、TNF-α以及MCP-1等的水平升高，而抗炎癥因子如脂聯素水平下降[13-15]，提示PCOS患者體內存在代謝性炎癥。PCOS卵巢局部亦存在炎癥反應[16]，研究顯示TNF-α、IL-6和IL-1在PCOS患者壁層顆粒細胞[17]以及PCOS大鼠模型卵巢組織的表達水平均升高[18]。PGRN作為一種脂肪炎性因子，在本實驗中亦被證實高表達于PCOS大鼠卵巢顆粒細胞層，進一步證實卵巢局部存在的炎癥反應。

高脂飲食能夠引起動物及人群的肥胖，導致與肥胖相關的代謝紊亂癥狀，增加炎癥細胞的浸潤及炎性反應的標記物表達，誘導肝臟的IR[19-20]。在本研究結束時，DHEA+HFD組體重顯著高于DHEA組(P<0.05)，且HOMA-IR指數顯著高于對照組(P<0.05)，提示HFD能有效誘導大鼠肥胖，并表現為IR。因此，用高脂飲食誘導的PCOS肥胖大鼠模型能很好的研究PCOS患者肥胖、IR及其相關代謝疾病的發生機制，對于PCOS肥胖、IR及2型糖尿病的預防和治療能夠提供較好的模型。

本研究中，DHEA組及DHEA+HFD組的大鼠PGRN表達增加，提示PGRN在PCOS大鼠中的表達增加；體重高的DHEA+HFD組大鼠PGRN表達水平較DHEA組高，提示肥胖能夠使PGRN的表達增加。既往研究亦證實，高脂飲食誘導的肥胖小鼠PGRN表達增加[5]。瞿華等[21]研究亦證實血漿PGRN水平在2型糖尿病及肥胖患者體內均升高，且其水平與糖脂代謝紊亂、肥胖、IR及炎癥的程度密切相關。其可能的機制為，高脂飲食導致肥胖產生，PCOS患者脂肪細胞增大、壞死，釋放的脂肪細胞因子從血液中招募巨噬細胞[22]。同時肥胖能夠激活炎癥信號通路，增加炎癥因子包括PGRN的表達。

本實驗首次證實PGRN表達于卵巢顆粒細胞層，并且PCOS大鼠PGRN蛋白的表達明顯增高，而肥胖的PCOS大鼠卵巢顆粒細胞中PGRN又顯著高于正常體重的PCOS大鼠，提示了肥胖與卵巢局部炎癥的關系；PGRN在各組卵巢中的差異性表達，提示PGRN可能通過作用于卵巢局部卵泡微環境，參與PCOS肥胖及慢性代謝性炎癥的發生，其具體相關性及機制需進一步的研究探討。

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[編輯：侯麗]

Expressionofprogranulininovaryinhighdietinducedoverweightratswithpolycysticovarysyndrome

LI Sai-jiao，ZHOU Dan-ni，LI Wei，YIN Tai-lang，YANG Jing*

ReproductiveMedicalCenter，HubeiClinicResearchCenterforAssistedReproductiveTechnologyandEmbryonicDevelopment，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060

Objective： To investigate the expression of progranulin (PGRN) in ovary in high diet induced overweight rats with polycystic ovary syndrome (PCOS).

Methods： Thirty eight rats aged 23 days were divided into three groups：normal control group (n=8)，DHEA group (n=15) and overweight PCOS group (DHEA+HFD，n=15).The overweight PCOS female rats were induced by dehydroepiandrosterone combined with high fat diet (DHEA+HFD).The pathological changes of ovary of PCOS rats were observed by HE staining.Serum levels of testosterone (T)，estradiol (E2) and fasting blood glucose (FBG)，fasting insulin (FINS) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.The expression level and distribution of PGRN in ovaries were detected by immunohistochemistry.

Results： The weight of DHEA+HFD group was significantly higher than that of control group (P<0.01) and DHEA group (P<0.05).The HOMA-IR in DHEA+HFD group and DHEA group was significantly higher than that in control group (P<0.05).The ovaries of rats modeled by DHEA in two groups showed typical polycystic changes.Additionally，the expression of PGRN in granulose cell layer was significantly up-regulated in DHEA and DHEA+HFD groups compared with control group (P<0.01)，and the PGRN expression in DHEA+HFD group was significantly higher than DHEA group (P<0.01).

Conclusions： The expression of PGRN is up-regulated in the granulosa cells of the PCOS rats.Obesity can further induce PGRN up-regulated in the granulosa cells of PCOS rats.It indicates that the differential expression of PGRN may be related to the pathogenesis of PCOS obesity and chronic inflammation.

Polycystic ovarian syndrome； Granulosa cell； Progranulin

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.09.013

2017-03-21；

2017-04-20

中央高校青年教師資助項目(2042016kf0086)；默克雪蘭諾生殖醫學基金(MerckSerono_CREATE-2016141)

李賽姣，女，云南玉溪人，博士，主治醫師，生殖醫學專業.(*

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