MMRN2在乳腺癌中的表達及對預后的影響

李華萍+孫圣榮+陳創+汪媛

[摘要] 目的 研究多聚蛋白-2（MMRN2）在乳腺癌中的表達及對預后的影響，探討其在乳腺癌發病機制中的作用。 方法 收集2013年1月～2017年4月在武漢大學人民醫院行手術切除的乳腺浸潤性導管癌標本和癌旁組織50例，采用Western blot和qRT-PCR檢測MMRN2的表達情況，分析MMRN2表達量高低與患者病理特征及預后的關系。 結果 MMRN2在乳腺癌組織中低表達（P < 0.01），MMRN2表達量高低與患者病理特征無明顯相關性（P > 0.05），MMRN2高表達可以延長乳腺癌患者總生存期（P=0.036）和無復發生存期（P=0.019）。 結論 MMRN2是乳腺癌的抑癌基因，可以作為一個潛在的乳腺癌分子治療靶點，提高患者生存期。

[關鍵詞] 多聚蛋白-2；乳腺癌；抑癌基因；預后

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（b）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of MMRN2 in breast cancer and its influence on prognosis， discuss the mechanism of MMRN2 in breast cancer. Methods Western blot and qRT-PCR were used to detect the expression of MMRN2 in 50 pairs of human breast invasive ductal carcinoma specimens and adjacent tissues， which had excision by surgery in Renmin Hospital of Wuhan University from January 2013 to April 2017. The relationship between the expression of MMRN2 and the pathologic features and prognosis of patients were analyzed. Results The expression of MMRN2 in breast cancer was down-regulated （P < 0.01）， and the expression of MMRN2 was not correlated with the pathological characteristics of patients （P > 0.05）. Up-regulated MMRN2 could prolong the overall survival （P = 0.036） and no recurrence survival time （P = 0.019） of patients with breast cancer. Conclusion MMRN2 is a tumor suppressor gene for breast cancer， and can serve as a potential target for molecular treatment of breast cancer， improve patients′ survival.

[Key words] MMRN2； Breast cancer； Anti-oncogene； Prognosis

乳腺癌是嚴重威脅女性健康與生命最常見的惡性腫瘤之一，其中乳腺浸潤性導管癌多發[1]。近年來我國乳腺癌發病率呈逐年上升趨勢。全球最新數據顯示，乳腺癌致死率在女性惡性腫瘤中排位第2位[2]。乳腺癌是一種異質性腫瘤，在分子表型、生物學、治療敏感性等方面存在著多樣性[3]。盡管雌激素受體內分泌治療在乳腺癌臨床控制中發揮著重要作用，然而內分泌治療耐藥和三陰性乳腺癌的問題大大減弱了其治療效果[4]。因此，尋求新的靶點，用分子生物學方法治療乳腺癌是目前研究的熱點。本研究分析了乳腺癌患者多聚蛋白-2（multimerin2，MMRN2）的表達情況，并觀察其與病理特征的關系，為分子靶向治療乳癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 組織標本

選擇2013年1月～2017年4月于武漢大學人民醫院普外科行手術切除的乳癌組織標本50例，并取同一病例的癌旁組織（距離癌組織>2 cm的乳腺組織）。術前患者均未接受任何放化療、內分泌治療，術后病理結果證實為浸潤性導管癌。患者均為女性，由病理學家根據世界衛生組織標準[5]進行乳腺癌分級。標本的獲取經武漢大學人民醫院倫理委員會審批，研究嚴格按照道德規范進行設計和實施，參與者均簽署知情同意書。所有標本獲取后用生理鹽水去除血漬，裝入凍存管后迅速保存于液氮中。

1.2 實時定量聚合酶鏈反應

取黃豆大小的組織標本液氮研磨至粉末狀，裝入1.5 mL離心管，加入1 mL Trizol置于室溫下裂解15 min，然后加入200 mL氯仿劇烈震蕩后冰上靜置10 min，4℃ 12000 r/min離心15 min。吸取上清液裝入干凈離心管中并加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，-20℃靜置20 min。4℃ 12000 r/min離心15 min棄上清液，配置75%乙醇溶液洗滌沉淀物2遍，用無RNA酶超純水溶解。使用Nandrop分光光度計（Thermo，美國）測量RNA濃度和純度。采用高效率逆轉錄試劑盒（QPK-201，日本）將RNA逆轉為cDNA，置于-20℃保存。按照Takara qRT-PCR試劑盒說明書進行操作，設立3個復孔，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參基因，采用實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測各基因的表達量。按95℃ 10 min，90℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 40 s，40個循環進行擴增，7500 Fast System SDS軟件（BIO-RAD，美國）分析Ct值，數據分析采用2-ΔΔCT計算方法。引物序列由武漢巴菲爾生物有限公司設計合成，詳見表1。endprint

1.3 蛋白質免疫印跡（Western blot）實驗

采用液氮碾磨法將乳腺癌組織磨至粉末狀，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液置于冰上充分裂解細胞15 min，4℃ 12000 r/min離心5 min，獲取細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，按照1∶1的比例加適量的上樣緩沖液（loading buffer），沸水浴煮10 min使蛋白變性，置于-80℃保存。制備SDS-PAGE凝膠，根據蛋白濃度計算出上樣體積，加樣。60 mA恒流電泳約1 h，轉膜，封閉，MMRN2一抗過夜孵育（Abbexa，北京），二抗（生物素標記山羊抗兔IgG 1∶10000）孵育，漂洗，經ECL試劑盒（BestBio，上海）顯色，凝膠成像系統（BIO-RAD，美國）掃描處理。

1.4 生物信息學

運用Blast軟件（http：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）設計MMRN2的引物。采用Kaplan-Meier plotter軟件（http：//kmplot.com/analysis/index.php？p=service&cancer=breast）預測MMRN2表達高低與乳腺癌患者預后的關系。

1.5 統計學方法

所有圖表運用GraphPad Prism 5（GraphPad Software，CA，USA）制作。采用IBM SPSS 20.0（IBM，USA）統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier分析和log-rank檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織中MMRN2 mRNA水平

測定50例乳腺浸潤性導管癌和對應癌旁組織中MMRN2的表達量。結果表明，MMRN2 mRNA在乳腺浸潤性導管癌標本中表達量明顯低于癌旁組織（P < 0.01）。見圖1。另外，分析MMRN2的表達水平與臨床病理特征的關系顯示，MMRN2表達量高低與患者年齡、腫瘤直徑、淋巴結轉移、組織學分級無顯著相關性（P > 0.05）。見表2。

2.2 乳腺癌組織中MMRN2蛋白水平

運用Western blot檢測乳腺浸潤性導管癌和對應癌旁組織總蛋白中MMRN2的表達量，結果表明：乳腺癌組織中MMRN2的蛋白表達量明顯低于癌旁組織（P < 0.05），提示MMRN2在乳腺癌中低表達。見圖2。

2.3 MMRN2表達高低與患者預后的關系

采用Kaplan-Meier plotter軟件預測MMRN2表達高低與616例患者總生存期（overall survival，OS）和1764例患者無復發生存期（recurrence-free survival，RFS）的情況。結果提示：MMRN2高表達的OS（logrank P=0.036）和RFS（logrank P=0.019）均高于MMRN2低表達的患者，差異有統計學意義。見圖3。

3 討論

乳腺癌是一種異質性疾病，不同的亞型具有不同的分子生物學和臨床過程。標準臨床和病理特征的評估傳統上用于確定在乳腺癌患者中是否使用輔助全身治療[6]。然而，通過識別特征，讓患者從輔助化療中受益仍然是一個挑戰，可能導致一些患者過度治療。分子醫學的進步大大提高了乳腺腫瘤基因表達譜的準確性，從而改善了預測患者乳腺癌復發風險的準確性和對內分泌治療和/或化學療法的可能反應能力[7-9]?；蚪M測定可輔助醫生在個體水平上為患者制訂個性化治療方案。目前通過檢測乳腺癌患者預后相關的基因，開發基因治療法，可直接或間接通過刺激抗腫瘤免疫行特異性靶向癌細胞治療。

MMRN2是與細胞表面緊密相關的ECM糖蛋白，包含p125、p140、p110和p200 4個不同的二硫鍵合亞基，具有信號肽、N末端EMI結構域和由中心卷曲螺旋富含區域分離的C末端C1q結構域的EMILIN樣蛋白[10]。MMRN2在正常和腫瘤血管系統中廣泛表達，是某些腫瘤中新血管形成的研究熱點[11]。MMRN2特別保存在內皮細胞中，與血管緊密排列，并且存在于血管的腔側[12]。然而，直到最近，MMRN2在血管生成和內皮細胞中的功能仍然難以捉摸[13]。Lorenzon等[11]最近發現了MMRN2的抗血管生成作用，它抑制內皮細胞遷移和血管組織而不影響增殖。MMRN2劑量依賴性地損害了成纖維細胞/內皮細胞共培養系統中微血管的形成，并大大減少了大鼠主動脈環的血管發芽[14]。在體內，MMRN2在鈣調素測定中抑制含血管內皮生長因子（VEGF）海綿體的血管生成發芽，但不抑制含有b-FGF的海綿70。實際上，MMRN2被發現直接結合VEGF-A，并干擾內皮細胞中的VEGF/VEGFR2信號傳導[15-16]。MMRN2取代了與HUVEC細胞結合的放射性標記VEGF，表明蛋白質干擾VEGF-VEGFR結合[12，17]。與MMRN2與內皮細胞表面密切相關的事實一致，MMRN2的細胞周期蛋白濃度很可能是富集的，并且是VEGF結合VEGFR2隔離和調節VEGF活性的重要競爭者。HT1080人纖維肉瘤細胞中MMRN2的穩定過表達通過抑制腫瘤血管生成顯著抑制裸鼠異種移植腫瘤生長[18]。直接腫瘤內注射重組MMRN2腺病毒也導致腫瘤抑制和抗血管生成作用，但程度較低。MMRN2作為一種血管生成抑制劑有幾個關鍵特征：首先，雖然MMRN2表現出泛內皮表達，但似乎并不影響正常的內皮細胞生長、增殖或凋亡。其次，MMRN2具有獨特的VEGF隔離機制，這種分子可以用來限制局部血管發生，以保持靜止狀態，或在病理狀態下作為VEGF信號的反饋調節劑。實際上，大多數ECM成員隔離VEGF也影響內皮細胞增殖[19-20]，但MMRN2表現出獨特的抑制作用，僅限于內皮細胞運動。最后，MMRN2對腫瘤生長和血管生成的影響開啟了將MMRN2開發成用于癌癥治療的新抗血管生成藥物的可能性。endprint

本文研究發現，MMRN2在乳腺癌中顯著低表達，且高表達患者預后優于低表達者，證明了MMRN2是乳腺癌的抑癌基因?？梢?，MMRN2可能參與了乳癌的浸潤與轉移。今后應行體內體外實驗進一步揭示乳癌發生及浸潤轉移機制，尋找預測轉移指標，為指導臨床靶向治療乳癌提供初步的實驗依據。

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