軟骨組織工程中種子細胞的研究進展

張治金++++++全仁夫++++++岳振雙++++++朱芳兵

[摘要] 組織工程修復軟骨缺損是組織工程技術運用于臨床最具可行性的研究領域之一，而種子細胞是軟骨組織工程研究及臨床應用的基本要素和首要環節。本文結合國內外的研究成果，對組織工程修復軟骨缺損中種子細胞的研究現狀進行回顧，綜述種子細胞的特點、來源、種類以及培養和鑒定，以期為軟骨組織工程的進一步發展提供依據。

[關鍵詞] 軟骨缺損；組織工程；種子細胞

[中圖分類號] R687.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（b）-0036-04

[Abstract] Tissue engineering cartilage repair tissue engineering technology is applied to the clinical one of the most feasible research field， and the seed cell is cartilage tissue engineering research and clinical application of the basic elements and the primary link. In this paper， combining the domestic and foreign research results， the research status of seed cells in cartilage defects repairing tissue engineering was reviewed. The characteristics， sources， species and culture of seed cells are reviewed in order to provide the basis for the further development of cartilage tissue engineering.

[Key words] Cartilage defect； Tissue-engineeved cartilage； Seeding cells

關節軟骨缺損帶來的頑固性疼痛和關節障礙，嚴重影響了患者的生活質量。隨著軟骨組織工程的發展給關節軟骨缺損的患者帶來了福音，利用組織工程技術修復軟骨缺損的研究及臨床應用取得較大的成功[1]。但軟骨組織修復工程在臨床上的直接應用尚有一段差距，因此有必要分析現有的研究和面臨的挑戰，以更好的縮短差距。而種子細胞是軟骨組織工程中最基本的，也是首要環節。本文就種子細胞的特點、來源、種類以及培養進行綜述。

1 種子細胞的特點

軟骨組織工程修復軟骨缺損的研究30余年，理想的種子細胞一直是研究的熱點，也是研究者們亟待解決的問題。它應該具備以下特點，①取材：便于獲取，來源豐富，且對供體的傷害降到最低；②增殖：增殖力強，在體外培養能迅速生長，增殖至構建軟骨組織所需的基礎細胞數；③黏附：黏附率高，可以較穩定的黏附支架生長；④生物學特性：遺傳背景穩定，構建的軟骨組織應與植入患者的生理軟骨具有相同的生物學功能，且在修復的各階段均能保持軟骨表型的穩定，維持自身穩態，在體內長期存活；⑤生物安全性：無明顯的免疫排斥或者免疫排斥反應不對機體造成傷害，同時在體外培養以及體內適應、重塑等階段毒性作用和致瘤性較小。經誘導后可向軟骨細胞分化是種子細胞的基本要求，而能分泌和合成軟骨細胞所需要的特異性基質是重要的條件之一。

2 種子細胞的來源

種子細胞的來源遵循種子細胞特有的要求，主要以自體、同種異體和異種為主。自體細胞取自患者自身，不發生免疫排斥反應是其最大的優點，但其取材可造成患者的創傷和痛苦，對于自身干細胞或者基因缺陷以及患有傳染性疾病的患者均不適宜選用自體細胞，且自體細胞存在數量局限以及多代培養出現細胞老化的問題。同種異體細胞可在事先進行培養制備，但其可能存在免疫排斥反應。異種細胞取材方便，來源廣泛，但其需要進行抗免疫排斥反應，存在動物病毒傳染的風險。但劉藝昌等[2]通過對同種異體和異種來源的骨髓間充質干細胞誘導軟骨細胞移植修復兔喉軟骨缺損，均取得良好的療效，且二者在修復效果上并無差距，這也無疑為種子細胞的來源提供了新的理論基礎。目前，在臨床上為了規避免疫排斥反應，種子細胞的主要來源集中于自體細胞，且隨著誘導多能干細胞技術的發展，自體多能干細胞為軟骨組織工程提供了更豐富、廣泛的種子細胞來源[3-4]。

3 種子細胞的種類

3.1 軟骨細胞

3.1.1 軟骨細胞的增殖

軟骨細胞作為關節軟骨組織工程的種子細胞源的關鍵在于軟骨細胞自身的維持以及其產生Ⅱ型膠原等細胞外基質的維持。然而軟骨細胞僅占軟骨組織的5%～10%，其體外擴增顯得尤為重要。國外學者發現，單層培養軟骨細胞，軟骨細胞的基因表達在第1代既已發生改變[5]。研究發現通過改變底物以及生長因子可以預防或減緩單層培養軟骨細胞所出現的去分化的問題[6]。同時，軟骨細胞擴增過程中影響細胞聚集物形態及行為的重要因素是種植的密度。Freed等[7]在藻（朊）酸鹽海綿上灌注進行軟骨細胞的培養，發現低密度的軟骨細胞種植密度的蓄積擴增率明顯高于中高密度的蓄積擴增率。

3.1.2 軟骨細胞的來源

自體軟骨細胞的提取簡易便行，通過胰蛋白酶及Ⅱ型膠原蛋白酶的作用，即可提取純度較高的軟骨細胞，不存在免疫反應，是最早應用的一類種子細胞。但因其是分化的終末自體細胞，增殖力低，一般在3代以后細胞表型發生改變，出現“去分化”現象，喪失成軟骨能力。同種異體軟骨細胞存在于細胞外基質中具有一定的抗免疫排斥的作用，又因在酶消化等處理后抗原性減弱，其免疫排斥作用不明顯，來源廣泛，有效的解決細胞來源不足的問題。但存在可能傳染疾病的風險，且也對供體造成傷害。異種軟骨細胞雖然可在短時間內大量獲取，但植入體內后免疫排斥嚴重，故臨床上較少應用。endprint

3.1.3 軟骨細胞的研究及應用

閆虎等[8]應用用Ⅱ型膠原酶消化并機械吹打的方法獲取大量生長速度快且不易退變的新西蘭兔膝關節的軟骨細胞，發現在3代以前的兔軟骨細胞最適宜。耿書國等[9]通過改良胰蛋白酶聯合Ⅱ型膠原酶序貫消化法、劉小榮等[10]采用單純Ⅱ型膠原酶法、王林林等[11]則采用機械-雙酶法提取軟骨細胞均可建立良好的軟骨細胞分離及培養體系。唐新等[12]取全膝關節置換患者殘存的軟骨用雙酶法進行提取及體外培養，在4代以內軟骨細胞生長良好，生物特性明顯，4代后出現“去分化”現象。王斌等[13]采用基質誘導自體軟骨細胞移植治療股骨滑車軟骨損傷10例，患者移植手術成功，且近期療效較好，創傷較小，恢復較快。Zhang等[14]的研究同樣也證明了自體軟骨細胞移植術可有效修復關節軟骨缺損。

3.2 干細胞

干細胞相對于成熟的軟骨細胞具有多向分化和較長時間或無限自我更新的能力，在組織工程修復軟骨缺損的研究中為研究熱點。其中胚胎干細胞以及間充質干細胞為重點的研究種子細胞。

3.2.1 胚胎干細胞

胚胎干細胞是一類高度未分化的細胞，其具備全能性、無限增殖性、易對基因進行修改、端粒酶活性高等生物特性，可在特定的條件下誘導分化成軟骨細胞。但是胚胎干細胞定向分化誘導成軟骨細胞是現階段的研究難點。在胚胎干細胞向軟骨細胞的定向分化的過程中，細胞外基質的組成、幾何構型及表面粗糙度、電荷性質都會對軟骨的形成產生巨大的影響。胚胎干細胞所處的環境可對軟骨細胞的增殖和純度產生影響，Jukes等[15]發現由4 mm厚度PEOT/PBT3D混合共聚物構成的軟骨支架更適用于軟骨細胞的分化。不同的誘導物對胚胎干細胞的分化能力是不同的，現已研究發現的誘導物除了細胞生長因子，還有地塞米松、甲狀腺素、前列腺素E2和抗壞血酸、中藥有效成分等。

3.2.2 間充質干細胞

間充質干細胞來源豐富，具有多向分化的能力，且不會因為來源不同而受到影響[16]，但是不同來源的間充質干細胞有特定的分化譜系，如骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞、滑膜間充質干細胞[17]、臍帶血間充質干細胞[18]等?，F階段骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞都是軟骨組織工程的研究熱點。

3.2.2.1 骨髓間充質干細胞 骨髓間充質干細胞來自中胚層，來源廣泛，具有高度自我更新和多向分化的潛能[19]；明顯的趨化性，向損傷組織集中；較強的免疫抑制性，利于自體或異體移植等生物特性，且其誘導分化成軟骨細胞的方法已經相對成熟。目前較常使用的分離骨髓間充質干細胞的方法是密度梯度離心與貼壁篩選結合，操作簡便且純度較高。研究證明，轉化生長因子（TGF）以及胰島素生長因子具有明顯誘導骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化[20]。另外地塞米松、維生素C、中藥[21]等也可誘導分化骨髓間充質干細胞向軟骨分化。骨髓間充質干細胞分化軟骨移植術治療軟骨缺損已應用于臨床。Bernardo等[22]通過實驗證明骨髓間充質干細胞相對于其他來源的種子細胞成軟骨能力最強。但是骨髓間充質干細胞數量較少，僅占骨髓細胞的1/104～1/105。另有研究發現骨髓間充質干細胞存在培養傳代至90代后癌變的風險[23]，其安全性還需要長期的研究和觀察。安榮澤等[24]研究發現在特定的單層培養條件下，脂肪干細胞及骨髓間充質干細胞均能向軟骨細胞轉化，但脂肪干細胞的生長增殖孫渡較快，而骨髓間充質干細胞具有更高的潛能。

3.2.2.2 脂肪間充質干細胞 脂肪間充質干細胞同樣來自中胚層，具有與骨髓間充質干細胞相似的生物特性，具有以下特點：取材方便，來源豐富，脂肪來源的間充質干細胞較骨髓間充質干細胞豐富；抗原性低；不易發生癌變，易體外進化；且具有多向分化的潛能。脂肪間充質干細胞在地塞米松、VD3以及細胞因子的誘導下可分化成軟骨細胞。國外研究表明脂肪間充質干細胞在多向分化潛能、生長動力學、細胞衰亡、表面標志等方面與骨髓間充質干細胞無明顯差異。郭寶鋒等[25]體外培養脂肪間充質干細胞，傳代穩定，間質細胞及干細胞相關標志CD34和CD13表達陽性，定向誘導后表現出軟骨特性。但研究表明，骨髓間充質干細胞分化軟骨細胞能力較脂肪間充質干細胞較強[26]。也有研究推測，雖然脂肪間充質干細胞雖然能分化成軟骨細胞，但骨髓重建能力有限[27]。

3.3 軟骨細胞和干細胞共培養

現有的單一來源的種子細胞無法滿足組織工程修復軟骨缺損的需要，體外單一因子培養擴增的軟骨因子往往無法與體內成熟的軟骨細胞融合修復；而干細胞分化成軟骨細胞所需的數量較大且分化培養費用昂貴，因此，越來越多的研究傾向于將兩類的種子細胞進行聯合培養。王萬宗等[28]選用第3代大鼠骨髓間充質干細胞與關節軟骨細胞按1∶1的細胞比例進行培養，發現軟骨細胞分泌物促進骨髓間充質干細胞向軟骨細胞樣分化，而骨髓間充質干細胞分泌的細胞因子，促進組織細胞分化，使關節軟骨細胞功能加強。謝鵬等[29]采用自體兔骨髓間充質干細胞與同種異體的軟骨細胞按照2∶1的細胞比例培養，發現共培養相對于單一軟骨細胞培養的模式，一方面軟骨細胞可促進骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化，另一方面減少軟骨細胞培養時間和傳代次數。李興福等[30]發現人臍帶間充質干細胞和人關節軟骨細胞的比例為5∶1時，可明顯促進人臍帶間充質干細胞向軟骨樣細胞誘導分化，并抑制細胞纖維化，降低成本。

4 種子細胞的培養

種子細胞采用單層細胞培養體系易向纖維細胞分化的傾向，目前僅用于軟骨細胞的擴增。三維立體培養體系有利于細胞的氣體交換，營養攝取以及廢物的排出，同時也有利于細胞外基質的分泌。三維立體培養可降解，可制成缺損軟骨所需要修復的形狀進行培養。生物反應器培養體系模擬人體內細胞和組織的生長環境，其要求種子細胞均勻的分布在三維結構上，給予一定的力學刺激，促進營養的供給和代謝的排出，降低成本。韓長旭等[31]發現理化因素在種子細胞的培養中，同樣占據著重要的作用，其通過對文獻的整理發現剪切力通常被對軟骨細胞表型認為是有害的，現有的培養模式中的理化刺激需要改進?，F有模擬微重力旋轉、固體轉動、攪動混合旋轉、環繞混合等生物反應器。Freed等[32]較為系統的研究了這4種生物反應器，發現模擬微重力旋轉生物反應器系統因提供了培養環境所需的力學平衡，促進了軟骨細胞的形成。endprint

5 小結與展望

隨著軟骨組織修復工程研究的發展，軟骨組織工程中種子細胞源越來越豐富，尤其是共培養軟骨細胞在提高軟骨細胞的質量和培養效率都取得了進步。雖然所面臨的前期困難已得到基本解決，如數量少、免疫性問題以及細胞表型不穩定等，但不可否認依然還存在諸多問題，如何確定種子細胞的安全性，提高種子細胞誘導分化的效率，其遠期療效的確定以及成分的降低。相信隨著種子細胞源的進一步豐富、純化及培養條件的優化，種子細胞的問題終將得以解決，縮短組織工程修復軟骨缺損深入臨床應用的距離。

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