桔梗皂苷D對肝癌干細胞活力和細胞凋亡的干預作用及其機制研究

宣麗楊

桔梗皂苷D對肝癌干細胞活力和細胞凋亡的干預作用及其機制研究

宣麗楊

目的探討桔梗皂苷D對肝癌干細胞活力和細胞凋亡的干預作用及其機制。方法MTT法和Annexin V染色流式細胞術檢測桔梗皂苷D和5-氟尿嘧啶對HepG2肝癌干細胞細胞活力和細胞凋亡的影響；采用Western blot檢測HepG2腫瘤干細胞HAX1表達；運用JC-1染色流式細胞術、Annexin V染色流式細胞術及Western blot方法研究桔梗皂苷D聯合5-氟尿嘧啶對肝癌干細胞凋亡通路的影響。結果5μmol/L 5-氟尿嘧啶處理下HepG2腫瘤干細胞活力抑制率為（29.1± 2.4）%，顯著低于常規HepG2細胞活力抑制率（72.7±5.2）%（P＜0.05）。5-氟尿嘧啶聯合桔梗皂苷D對HepG2腫瘤干細胞的細胞活力抑制率為（66.7±3.4）%，凋亡誘導率為（33.9±2.1）%，顯著高于5-氟尿嘧啶單獨處理的細胞活力抑制率[（28.7±1.8）%，P＜0.05]和凋亡誘導率[（8.9±0.6）%，P＜0.05]。桔梗皂苷D處理后HepG2腫瘤干細胞HAX1相對表達水平比對照組顯著下降[（0.24±0.02）比（0.78± 0.05），P＜0.05]；5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D+HAX1質粒組HepG2腫瘤干細胞凋亡率顯著低于5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D組[（10.1±0.7）%比（34.8±2.2）%，P＜0.05]；5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D組HepG2腫瘤干細胞相對線粒體膜電位顯著低于5-氟尿嘧啶組[（0.21±0.02）比（0.84±0.04），P＜0.05]。結論桔梗皂苷D可能通過下調HAX1表達抑制肝癌干細胞對5-氟尿嘧啶的抵抗性。

肝癌干細胞；HAX1；線粒體；凋亡；桔梗皂苷D；5-氟尿嘧啶

文獻[1-2]報道，腫瘤干細胞（tumor stem cells，TSCs）對化療存在抵抗性，是導致腫瘤復發的重要因素。肝癌是常見的消化系統腫瘤之一，惡性程度高，患者預后往往不良，五年存活率較低[3]。5-氟尿嘧啶是治療肝癌的重要化療藥物，然而5-氟尿嘧啶的長期治療往往造成腫瘤細胞對其發生抵抗[4]，因此抑制腫瘤細胞尤其是腫瘤干細胞對5-氟尿嘧啶的耐藥性具有十分重要的意義。本文旨在研究桔梗皂苷D對肝癌干細胞細胞活力和細胞凋亡的干預作用及其機制研究。

1 材料與方法

1.1 材料DMEM培養基購于美國Gibco。噻唑藍（MTT）、桔梗皂苷D和5-氟尿嘧啶購于美國Sigma-Aldrich。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒（貨號：88-8005-72）購于美國ebioscience。造血細胞特異性蛋白相關蛋白1（HAX1）抗體、活化型半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3）抗體和β-肌動蛋白（β-actin）抗體購于美國CellSignaling。JC-1（5，5′，6，6′-Tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl imidacarbo cyanine iodide）染料購于美國Molecular Probes。CD133-FITC熒光抗體購于美國BD公司。增強型化學發光底物（ECL）試劑盒（貨號：32106）購于美國Pierce。脂質體2000（Lipofectamine 2000）購于美國Invitrogen。

1.2 細胞培養人肝癌細胞系HepG2購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。HepG2腫瘤干細胞用流式細胞儀進行分選，CD133陽性的HepG2細胞即為HepG2腫瘤干細胞[5]。常規HepG2細胞及HepG2腫瘤干細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養環境為37°C恒溫培養箱中培養并通入5%CO2。

1.3 質粒構建和轉染將HAX1基因（Gene ID：NM_001018837.1）的開放閱讀框架序列經PCR擴增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構建成HAX1重組真核表達質粒。HAX1表達質粒用Lipofectamine2000按試劑操作說明書步驟進行轉染，將2μg/mL HAX1表達質粒轉染入HepG2腫瘤干細胞中。

1.4 細胞活力檢測將HepG2腫瘤細胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對照組、桔梗皂苷D組、5-氟尿嘧啶組、5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D組和5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D+HAX1質粒組。對照組為腫瘤細胞不加藥物培養48h，5-氟尿嘧啶組為在腫瘤細胞中加入5μmol/L的5-氟尿嘧啶培養48h，桔梗皂苷D組為在腫瘤細胞中加入2μmol/L的桔梗皂苷D培養48h，5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D組為在腫瘤細胞中加入5μmol/L的5-氟尿嘧啶和2μmol/L的桔梗皂苷D培養48h，5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D+HAX1質粒組為先將2μg/mL的HAX1表達質粒轉染入腫瘤細胞中培養24h，之后更換培養基再加入5μmol/L的5-氟尿嘧啶和2μmol/L的桔梗皂苷D繼續培養48h。藥物處理完畢后在培養體系中加入20μL 5g/L MTT再培養4h，棄去上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，在570nm波長下用酶標儀檢測OD值，細胞活力抑制率計算公式：抑制率=（OD對照組-OD治療組）/ OD對照組×100%。

1.5 細胞凋亡實驗將細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進行分組處理。處理完畢后按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細胞中暗室孵育20min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細胞數占總細胞數的百分比表示。

1.6 Western blot實驗將細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進行分組處理。藥物處理完畢后將細胞用蛋白提取液提取總蛋白質。之后將提取的總蛋白質用12%SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到PVDF膜上，用HAX1抗體，cleaved Caspase-3抗體或βactin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。蛋白灰度值分析用Image J軟件處理。目標蛋白的相對表達水平用它們的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

1.7 線粒體膜電位測定將細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進行分組處理。處理完畢后按試劑操作說明書步驟將細胞用JC-1染料進行孵育。20min后，將細胞用生理鹽水洗滌3遍，之后用流式細胞儀檢測JC-1發出的紅色熒光，紅色熒光強度越強，線粒體膜電位越高[6]。治療組的相對線粒體膜電位為各治療組的JC-1熒光強度與對照組熒光強度的比值。

2 結果

2.1 各組HepG2腫瘤干細胞細胞活力抑制率與凋亡率比較MTT實驗結果顯示，不同濃度5-氟尿嘧啶對HepG2腫瘤干細胞的殺傷活性顯著低于常規HepG2細胞（P均＜0.05），表明HepG2腫瘤干細胞對5-氟尿嘧啶有明顯的抵抗性（見圖1）。聯用桔梗皂苷D后，5-氟尿嘧啶對HepG2腫瘤干細胞的殺傷活性和凋亡誘導活性顯著增強（P均＜0.05），表明桔梗皂苷D能明顯抑制HepG2腫瘤干細胞對5-氟尿嘧啶的抵抗性。見表1。

圖1 不同濃度5-氟尿嘧啶對常規HepG2細胞及HepG2腫瘤干細胞細胞活力的影響

2.2 各組HAX1表達水平和HepG2腫瘤干細胞凋亡率比較Western blot結果顯示，桔梗皂苷D處理能顯著抑制HepG2腫瘤干細胞抗凋亡蛋白HAX1表達水平（P＜0.05），而5-氟尿嘧啶對HAX1表達無影響（P＞0.05），表明HAX1可能是桔梗皂苷D作用靶點。當轉染HAX1質粒后，桔梗皂苷D不能協同5-氟尿嘧啶誘導HepG2腫瘤干細胞發生凋亡（P＜0.05），表明桔梗皂苷D可能通過下調HAX1表達水平增強5-氟尿嘧啶對HepG2腫瘤干細胞的凋亡誘導活性，見表2。

2.3 各組HepG2腫瘤干細胞線粒體膜電位和Caspase-3表達水平比較流式細胞實驗結果顯示，聯用桔梗皂苷D后，5-氟尿嘧啶對HepG2腫瘤干細胞線粒體膜電位的損傷作用明顯增強（P＜0.05），Western blot結果顯示，聯用桔梗皂苷D能顯著增強5-氟尿嘧啶對HepG2腫瘤干細胞Caspase-3活化（P＜0.05）。然而，轉染HAX1質粒后，桔梗皂苷D對線粒體膜電位和Caspase-3干預作用受到明顯抑制（P＜0.05）。表明桔梗皂苷D可能通過下調HAX1表達促進5-氟尿嘧啶誘導的線粒體途徑的凋亡，見表3。

3 討論

新近研究發現，腫瘤組織中的腫瘤干細胞往往對化療不敏感，它們能通過改變自身的基因表達產生對化療藥物的抵抗性，腫瘤干細胞還有很高的自我更新能力，化療后存活的腫瘤干細胞常導致腫瘤的復發[7-8]。桔梗皂苷D是桔梗科植物桔梗干燥根中提取的有效活性成分，具有抗炎、鎮痛和免疫調節的作用。文獻報道，桔梗皂苷D對多種腫瘤有一定的抑制作用，在體外能促進腫瘤細胞的凋亡和周期阻滯[9-11]，然而其對腫瘤干細胞的生物活性至今卻仍很少報道。本研究發現桔梗皂苷D能顯著逆轉肝癌干細胞對5-氟尿嘧啶的抵抗性，表明桔梗皂苷D能作為一種輔助治療藥物增強5-氟尿嘧啶對肝癌干細胞的殺傷活性，提高化療有效率。

表1 各組HepG2腫瘤干細胞細胞活力抑制率與凋亡率比較（%，）

表1 各組HepG2腫瘤干細胞細胞活力抑制率與凋亡率比較（%，）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與桔梗皂苷D組比較，△P＜0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，▲P＜0.05

組別對照組桔梗皂苷D組5-氟尿嘧啶組5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D組孔數5-氟尿嘧啶（μmol/L）桔梗皂苷D（μmol/L）3 3 3 3 0 0 5 5 0 2 0 2細胞活力抑制率0 5.8±0.5 28.7±1.8* 66.7±3.4△▲凋亡率1.8±0.2 2.6±0.3 8.9±0.6* 33.9±2.1△▲

表2 各組HAX1表達水平和HepG2腫瘤干細胞凋亡（）

表2 各組HAX1表達水平和HepG2腫瘤干細胞凋亡（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，▲P＜0.05；與5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D組比較，#P＜0.05

組別對照組桔梗皂苷D組5-氟尿嘧啶組5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D組5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D+HAX1質粒組孔數5-氟尿嘧啶（μmol/L）桔梗皂苷D（μmol/L）HAX1質粒（μg/mL）3 3 3 3 3 0 0 5 5 5 0 2 0 2 2 0 0 0 0 2 HAX1相對表達水平0.78±0.05 0.24±0.02* 0.80±0.05 0.25±0.02▲0.92±0.06#凋亡率（%）1.9±0.2 2.6±0.3 8.8±0.6* 34.8±2.2▲10.1±0.7#

表3 各組HepG2腫瘤干細胞線粒體膜電位和Caspase-3表達水平比較（）

表3 各組HepG2腫瘤干細胞線粒體膜電位和Caspase-3表達水平比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，▲P＜0.05；與桔梗皂苷D組比較，△P＜0.05；與5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D組比較，#P＜0.05

組別對照組桔梗皂苷D組5-氟尿嘧啶組5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D組5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D+HAX1質粒組孔數5-氟尿嘧啶（μmol/L）桔梗皂苷D（μmol/L）HAX1質粒（μg/mL）3 3 3 3 3 0 0 5 5 5 0 2 0 2 2 0 0 0 0 2相對線粒體膜電位1.00±0.05 0.94±0.04 0.84±0.04* 0.21±0.02▲△0.77±0.03#Cleaved Caspase-3相對表達水平0.01±0.01 0.03±0.01 0.09±0.02* 0.58±0.04▲△0.14±0.02#

HAX1是一種定位在線粒體外膜上的抗凋亡蛋白[12]。研究表明，HAX1過表達能阻礙腫瘤細胞的凋亡途徑，抑制由藥物或其他環境因素引起的腫瘤細胞線粒體的損傷，因此，包括腫瘤細胞的HAX1往往過度表達，且HAX1的過表達程度與腫瘤細胞對化療藥物的敏感性呈負相關[13]。在本研究中，筆者發現桔梗皂苷D在HepG2腫瘤干細胞中的直接靶點是HAX1蛋白，桔梗皂苷D輔助治療能顯著降低HepG2腫瘤干細胞HAX1表達水平。當在肝癌干細胞中轉染HAX1質粒強制增加它的表達水平后，桔梗皂苷D聯合5-氟尿嘧啶對肝癌干細胞線粒體的損傷作用受到顯著抑制，同時Caspase-3的活化也受到明顯抑制，表明桔梗皂苷D通過抑制HAX1的表達抑制肝癌干細胞對線粒體途徑凋亡的抵抗性，提高5-氟尿嘧啶對肝癌干細胞的殺傷活性。

本研究結果顯示，桔梗皂苷D能顯著抑制肝癌干細胞對5-氟尿嘧啶的抵抗性。其機制為桔梗皂苷D可能通過下調HAX1表達促進5-氟尿嘧啶對肝癌干細胞線粒體的損傷進而誘導腫瘤細胞發生Caspase-3依賴的凋亡。這些研究結果為逆轉腫瘤細胞對5-氟尿嘧啶的抵抗性，提高其療效提供新的思路和理論依據。

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（收稿：2017-02-05 修回：2017-05-20）

Intervention of Platycodin D on Viability and Apoptosis of Liver Cancer Stem Cells and Its Related Mechanism

XUAN Liyang.Department of Clinical Laboratory,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

ObjectiveTo investigate the role of platycodin D in inhibiting the resistance of liver cancer stem cells to 5-fluorouracil.MethodsMTT assay and Annexin V staining were performed to investigate the effect of platycodin D and 5-fluorouracil on cell viability and apoptosis in HepG2 cancer stem cells.Western blot analysis was performed to investigate the effect of platycodin D on regulating the expression of HAX1 in HepG2 cancer stem cells.JC-1 staining,Annexin V staining and western blot analysis was performed to investigate the apoptotic pathway in HepG2 cancer stem cells treated with platycodin D and 5-fluorouracil.ResultsCell viability inhibitory rate of HepG2 cancer stem cells treated with 5mol/L 5-fluorouracil was（29.1±2.4）%,which was significantly lower than the routine HepG2 cells[（72.7±5.2）%,P＜0.05].Cell viability inhibitory rate and apoptotic rate of HepG2 cancer stem cells co-treated with 5-fluorouracil plus platycodin D were（66.7±3.4）%and（33.9±2.1）%,respectively, which were significantly higher than the cell viability inhibitory rate[（28.7±1.8）%,P＜0.05]and apoptotic rate[（8.9± 0.6）%,P＜0.05]of HepG2 cancer stem cells treated with 5-fluorouracil alone.Relative expression of HAX1 in platycodin D treatment group was significantly lower than that in control group（0.24±0.02 vs 0.78±0.05,P＜0.05）. Apoptotic rate in 5-fluorouracil+platycodin D+HAX1 plasmid treatment group was significantly lower than that in the 5-fluorouracil+platycodin D group[（10.1±0.7）%vs（34.8±2.2）%,P＜0.05];relative mitochondrial membrane potential in 5-fluorouracil+platycodin D treatment groupis significantly lower than that in 5-fluorouracil alone group（0.21±0.02 vs 0.84±0.04,P＜0.05）.ConclusionPlatycodin D may inhibit the resistance of liver cancer stem cells to 5-fluorouracil via down-regulating the expression of HAX1.

liver cancer stem cells;HAX1;mitochondria;apoptosis;platycodin D;5-fluorouracil

book=756,ebook=25

浙江省立同德醫院檢驗科（杭州310012）