破壁靈芝孢子粉對ConA誘導免疫性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST水平及肝組織炎癥程度的影響

趙燕平馮彩珠付昌隆華海燕

破壁靈芝孢子粉對ConA誘導免疫性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST水平及肝組織炎癥程度的影響

趙燕平1馮彩珠2付昌隆2華海燕3

目的探討破壁靈芝孢子粉對ConA誘導免疫性肝損傷模型小鼠血清谷丙氨酸轉氨酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平及肝組織炎癥程度的影響。方法雄性Balb/c小鼠隨機分成正常組10只，模型組、低劑量破壁靈芝孢子粉組（低靈組）、高劑量破壁靈芝孢子粉組（高靈組），各12只。除正常組外，其余各組用ConA 5mg/kg尾靜脈注射，隔天1次，共2周，建立免疫性肝損傷小鼠模型。正常組和模型組小鼠分別用等容量生理鹽水灌胃，低靈組及高靈組小鼠分別給予破壁靈芝孢子粉1.0g/kg、2.0g/kg灌胃。4周后檢測各組小鼠血清ALT、AST水平及觀察肝組織炎癥程度。結果低靈組、高靈組小鼠血清ALT、AST水平明顯低于模型組[ALT：（129.62±44.65）U/L、（92.76±33.78）U/L比（201.78±62.47）U/L，P＜0.05；AST：（134.38±42.67）U/L、（101.76±34.56）U/L比（223.63±77.31）U/L，P＜0.05]；高靈組小鼠血清ALT、AST水平及肝組織炎癥程度明顯低于低靈組（P＜0.05）；低靈組及高靈組小鼠肝細胞變性、壞死及炎癥細胞浸潤程度比模型組明顯減輕（P＜0.05）；結論破壁靈芝孢子粉能改善ConA誘導免疫性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST水平及肝組織炎癥程度。

小鼠；ConA；免疫損傷；破壁靈芝孢子粉；ALT；AST；肝組織炎癥

KEY WORDSmice;ConA;immune injury;broken Ganoderma lucidum spore powder;ALT;AST;inflammation of liver tissue

隨著慢性乙型病毒性肝炎發病中免疫反應機制的研究深入，越來越多的學者認為機體的免疫功能低下，尤其是細胞免疫功能低下，是導致乙型肝炎病毒（HBV）感染后發病及病情向慢性化轉歸的重要因素，只有使機體產生有效的抗病毒免疫應答，才能真正達到臨床完全控制病毒復制甚至清除病毒的目的[1-2]。現有的抗病毒藥物難以達到理想的抗病毒療效，因此尋找一種安全有效的免疫調節劑成為慢乙肝臨床治愈的突破口。ConA是誘導免疫性肝損傷的經典試劑，其作用機制與T細胞和KC細胞相關，與人類慢性肝炎發病機制非常相似[3-4]。破壁靈芝孢子粉是一種珍貴的藥用真菌，具有免疫調節及保肝解毒作用。為探討破壁靈芝孢子粉是否對慢性肝炎存在免疫調節作用，本研究采用刀豆蛋白A（ConA）造模，破壁靈芝孢子粉干預，觀察模型小鼠血清谷丙氨酸轉氨酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平及肝組織炎癥程度變化，以期為慢性乙型病毒性肝炎的破壁靈芝孢子粉治療慢性乙型病毒性肝炎提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物采用清潔級Balb/c雄性小鼠46只，體質量20～30g，6～8周齡，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（瀘）2013-2016，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心屏障環境內，使用許可證號SYXK（浙）2013-0184，環境溫度（23±1）℃，相對濕度50%～65%，飼喂全價營養顆粒飼料，自由飲水。

1.2 藥物和試劑破壁靈芝孢子粉（壽仙谷藥業公司生產），使用時用生理鹽水調配成兩種濃度備用：低劑量組0.1g/mL和高劑量組0.2g/mL；刀豆蛋白A（ConA）購自Sigma公司（C2010，批號80M7680V），使用時溶于生理鹽水；谷丙氨酸轉氨酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑購自德國DiaSys DiagoticsSystemsGmbH（批號分別為07235/ 00002244、07218/00001951）。

2 實驗方法

2.1 分組造模與給藥將46只Balb/c雄性小鼠正常飼養1周后用隨機數字表法分為四組：正常組10只，模型組、低劑量破壁靈芝孢子粉組（低靈組）和高劑量破壁靈芝孢子粉組（高靈組）各12只。正常小鼠正常飼養。模型組及低靈組、高靈組小鼠給予ConA 5mg/kg尾靜脈注射，隔天1次，共2周。造模成功后，正常組及模型組予生理鹽水0.1mL/10g灌胃，低靈組和高靈組分別用破壁靈芝孢子粉以1.0g/kg及2.0g/ kg灌胃，共4周。

2.2 血清ALT、AST檢測4周后摘除小鼠眼球取血，檢測ALT、AST水平，由浙江中醫藥大學動物實驗中心協助完成。

2.3 肝組織病理學檢查取小鼠肝組織經固定、包埋、切片、染色后鏡檢，由浙江中醫藥大學動物實驗中心病理室及解放軍117醫院病理科協助完成。肝組織炎癥活動度積分標準按王泰齡等方案[5]。

2.4 統計學方法應用SPSS12.0軟件進行統計處理，計量資料以（） 表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 破壁靈芝孢子粉對小鼠血清ALT、AST水平的影響實驗過程中，由于灌胃操作失誤，導致高靈組死亡2只，低靈組死亡1只。破壁靈芝孢子粉干預后，高、低靈組小鼠ALT、AST水平較模型組明顯降低，高靈組較低靈組明顯降低，差異有統計學意義（P均＜0.05）。提示破壁靈芝孢子粉可以改善ConA誘導的免疫性肝損傷。見表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較（U/L，）

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較（U/L，）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與低靈組比較，▲P＜0.05；ALT：谷丙氨酸轉氨酶；AST：門冬氨酸氨基轉移酶

組別正常組模型組高靈組低靈組鼠數10 12 10 11 ALT 67.45±23.46 201.78±62.47* 92.76±33.78△▲129.62±44.65△AST 86.45±28.76 223.63±77.31* 101.76±34.56△▲134.38±42.67△

3.2 破壁靈芝孢子粉對小鼠肝組織炎癥程度的影響光鏡下觀察顯示，正常組小鼠肝小葉清晰,肝索呈放射狀排列，規則有序，肝竇未見異常；模型組小鼠肝組織均出現明顯病變，肝小葉結構嚴重破壞，肝細胞普遍變性，混濁腫脹，胞漿疏松，部分呈氣球樣變，可見明顯的點、灶狀壞死，匯管區淋巴細胞和單核細胞炎性浸潤尤為明顯；低靈組及高靈組小鼠在肝細胞變性及壞死及炎細胞浸潤較模型組明顯減輕（P＜0.05）；高靈組小鼠肝細胞變性及壞死較低靈組明顯減輕（P＜0.05）。見表2、插頁圖1～4。

表2 各組小鼠肝組織炎癥程度比較（）

表2 各組小鼠肝組織炎癥程度比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與低靈組比較，▲P＜0.05

組別正常組模型組高靈組低靈組鼠數10 12 10 11肝細胞壞死肝細胞變性炎細胞浸潤-++-++-++ 101010 0 1 0 + 0 0 6 5 0 4 3 4 +++ 0 8* +++ 0 9* +++ 0 7* 0△▲2△0 3 2 + 0 0 6 3 0 3 1 6 0△▲0△0 0 0 + 0 0 4 5 0 5 6 6 0△0△

4 討論

機體感染HBV后引起細胞免疫和體液免疫應答，并激發自身免疫反應及免疫調節功能紊亂，導致機體特異性免疫功能損傷，無法控制病毒復制和清除，致使HBV感染慢性化甚至進展為肝硬化、肝癌。只有使機體產生了有效的抗病毒免疫應答，才能真正達到臨床完全控制病毒復制甚至清除病毒的目的，但是現有的抗病毒藥物未能達到理想的抗病毒療效。目前，臨床上應用較多的慢性乙型病毒性肝炎免疫調節劑主要有胸腺肽、治療性乙肝疫苗、重組細胞因子等[6-7]，以上免疫調節治療療效肯定，但價格昂貴、注射不便導致依從性差，且很多免疫細胞因子治療局限在動物實驗或小樣本臨床研究，目前難以普及。

靈芝，又稱“仙草”，是一種珍貴的藥用真菌。靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來的淡霧狀的極其微小的孢子，孢子內含有比靈芝更豐富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白質、酶類、硒元素等特殊成分物質,具有免疫調節、保肝解毒、抗肝纖維化、抗腫瘤、抗病毒等許多藥理作用[8]。諸多研究[9-10]提示，破壁靈芝孢子粉可調節小鼠的細胞免疫和體液免疫功能，并能有效增強小鼠NK細胞活性和單核—巨噬細胞吞噬功能，且效果較未破壁靈芝孢子粉好。

刀豆蛋白A（ConA）誘導的肝損傷是模擬與免疫相關肝病研究T細胞依賴的最好模型之一,其特點是白細胞分化抗原4（CD4+）T細胞增多所介導，與慢性乙型病毒性肝炎發病的免疫反應機制相似。我們以ConA誘導小鼠為模型，觀察破壁靈芝孢子粉干預后的血清ALT、AST及肝組織炎癥程度的變化，發現藥物干預后小鼠血清ALT、AST水平較模型組明顯降低，且高劑量組護肝效果優于低劑量組，藥物干預后的肝組織內炎癥程度也較模型組明顯改善，但高、低靈組之間炎癥改善差別不明顯。說明破壁靈芝包子粉可以改善ConA誘導的小鼠免疫損傷，降低血清ALT、AST水平，且護肝效果隨劑量增大相應增強。

［1］王福生，張政.宿主免疫狀態決定慢性乙肝的轉歸和臨床療效［C］.第六屆全國免疫學術大會論文集.2008：38-40.

［2］曾躍紅，田海清，王新華，等.乙型病毒性肝炎臨床轉歸與機體細胞免疫功能狀況的相關性研究［J］.中國醫藥導報，2015，12（5）：8-11，21.

［3］Elmar J.Animal Models of Autoimmune Hepatitis［M］.Mackay IR，Rose NR，Ledford DK，et al.Encyclopedia of medical immunology.Springer：New York，2014：325-337.

［4］Shao X，Qian Y，Xu C，et al.The protective effect of intrasplenic transplantation of Ad-IL-18BP/IL-4 gene-modified fetal hepatocytes on ConA-induced hepatitis in mice［J］.PLoS One，2013，8（3）：e58836.

［5］王泰齡，劉霞，周元平，等.慢性肝炎炎癥活動度及纖維化程度積分方案［J］.中華肝臟雜志，1998，6（4）：195-197.

［6］張旋，左維澤，買力坎木，等.阿德福韋酯聯合胸腺肽治療拉米夫定耐藥慢性乙型肝炎患者前后IL-10和IL-18的變化及意義［J］.吉林醫學，2013，34（28）：5798-5800.

［7］操躍.慢性乙型肝炎的抗病毒研究進展［J］.藥學實踐雜志，2015，33（6）：561-565.

［8］唐柳，張志軍，魏雪生，等.靈芝孢子粉藥理作用研究進展［J］.天津農業科，2011，17（3）：25-28.

［9］楊雋，帥怡，肖萍，等.靈芝破壁抱子粉對小鼠免疫功能影響的實驗研究［C］.第四屆第二次中國毒理學會食品毒理學專業委員會與營養食品所毒理室聯合召開學術會議論文集，2008：240-244.

［10］黃梅.靈芝制劑對小鼠免疫功能調節作用的研究［D］.吉林大學，2012.

（收稿：2017-04-11 修回：2017-05-14）

Effect of Broken Ganoderma Lucidum Spore Powder on Serum ALT,AST Levels and Liver Inflammation in Mice with ConA-induced Immune Injury

ZHAO Yanping1,FENG Caizhu2,FU Changlong2,HUA Haiyan3.1

Department of Infectious Disease,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310006),China;2 The First College of Clinical Medicine,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;3 Department of Pathology, the 117th Hospital of PLA,Hangzhou(310007),China

ObjectiveTo investigate the effect of broken Ganoderma lucidum spore powder on serum ALT,AST levels and liver inflammation in mice with ConA-induced immune injury.MethodsBalb/c male mice were randomly divided into 4 groups∶normal group（n=10）,model group（n=12）,low dose group（with 1.0g/kg broken Ganoderma lucidum spore powder,n=12）and high dose group（with 2g/kg broken Ganoderma lucidum spore powder,n= 12）.Except normal group,the immune damage model was established by intravenous injection of ConA（5mg/kg）for 2 weeks.Normal group and model group were treated with normal saline.After 4 weeks,the levels of ALT, AST and the degree of liver inflammation were observed.ResultsThe ALT and AST levels of low dose group and high dose group were significantly lower than those of model group（ALT∶129.62±44.65U/L,92.76±33.78U/L vs 201.78±62.4U/L,P＜0.05;AST∶134.38±42.67U/L,101.76±34.56U/L vs 223.63±77.31U/L,P＜0.05）;the levels of ALT,AST and the inflammation of liver tissue in high dose group were lower and milder than those of low dose group（P＜0.05）.The degree of liver cell degeneration，necrosis and inflammation of low dose group and high dose group were significantly milder than those model group（P＜0.05）.ConclusionBroken Ganoderma lucidum spore powder can improve the level of serum ALT,AST and inflammation of liver tissue in mice with ConA-induced immune injury.

book=760,ebook=29

浙江省自然科學基金青年科學基金項目（No.LQ14H90005）

1浙江省中醫院感染科（杭州310006）；2浙江中醫藥大學第一臨床醫學院（杭州310053）；3中國人民解放軍117醫院病理科（杭州310007）

趙燕平，Tel：15924186653；E-mail：xiaoke_bao_a@163.com