通心絡對大鼠心肌缺血再灌注損傷中肥大細胞脫顆粒誘導的炎癥反應的作用機制*

黃 婷 李紹旦 李 涵 張俊修 劉 毅 楊明會△

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中國人民解放軍總醫院，北京 100853）

通心絡對大鼠心肌缺血再灌注損傷中肥大細胞脫顆粒誘導的炎癥反應的作用機制*

黃 婷1，2李紹旦2李 涵2張俊修2劉 毅2楊明會2△

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中國人民解放軍總醫院，北京 100853）

目的 觀察通心絡對肥大細胞干預的缺血再灌注模型大鼠心肌損傷的保護作用并探討其機制。方法

將36只健康成年雄性SD大鼠隨機分成假手術組、模型組、通心絡組。通過可逆性左冠狀動脈前降支結扎法建立心肌缺血再灌注模型，大鼠心肌缺血1 h，再灌注2 h；假手術組僅穿線不結扎。通心絡組大鼠予通心絡灌胃，假手術組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃。1周后采用HE染色方法觀察心肌組織病理改變，取腹主動脈血檢測血常規、生化、血清脾酪氨酸激酶（Syk）、細胞外信號調節激酶（ERK）的磷酸化水平以及5-羥色胺（5-HT）等指標。結果 通心絡組大鼠5-HT的表達及Syk的磷酸化水平較模型組均明顯降低，ERK的磷酸化水平較模型組明顯升高（P＜0.01）。結論 通心絡通過降低5-HT及Syk的磷酸化水平，升高ERK的磷酸化水平，抑制肥大細胞脫顆粒誘導的炎癥反應，減輕心肌損傷，進而保護心肌組織。

通心絡 心肌缺血再灌注 肥大細胞脫顆粒 炎癥反應

在冠脈缺血基礎上恢復血流時，組織細胞損傷反而加重，甚至發生不可逆性損傷，此現象稱為心肌缺血再灌注損傷（MIRI），對于挽救缺血心肌，減輕心肌組織微血管的損傷，降低病死率是一大難題［1］。根據其病位和臨床表現，應屬于中醫學“胸痹”“真心痛”“心悸”范疇，基本病機為本虛標實；標實為氣滯、血瘀、痰飲、寒凝、熱結等，本虛包括氣血陰陽的虛損。中藥復方通心絡以吳以嶺院士“由絡以通、交會生化”的絡病理論為指導，以全蝎、蜈蚣、蟬蛻搜積通絡，水蛭、土鱉蟲剔除絡瘀，桂枝、薤白、降香疏絡暢氣，人參、黃芪補氣通絡，全方滲灌氣血、濡養代謝［2］。本研究從模型大鼠心肌凋亡程度以及肥大細胞脫顆粒誘導的炎癥反應等方面，探討通心絡對受損心肌的保護作用及機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 1）實驗動物。SPF級SD雄性大鼠36只，購自軍事醫學科學院動物中心，許可證號SCXK-（軍）2012-0004）；體質量（240±20） g，每籠 5 只飼養于獨立通氣籠具系統內。溫度（22±1） ℃，濕度（50±5） %，每天光照與黑夜時間各12 h。實驗期間造模、取材等操作均在超凈工作臺內進行，添加飼料、換水、灌藥等由專人負責管理。2）藥物及試劑。通心絡超微粉（石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號SY1605001）；烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司，批號T2011110）；4%多聚甲醛（盛生物技術有限責任公司，批號AR-0211）；蘇木素染液、伊紅染液（北京雪邦科技有限公司）；5-羥色胺（5-HT）ELISA檢測試劑盒（上海喬羽生物科技有限公司，批號YM-R30326）；脾酪氨酸激酶（Syk）ELISA檢測試劑盒（上海喬羽生物科技有限公司，批號YMR10956）；細胞外信號調節激酶（ERK）ELISA檢測試劑盒（上海喬羽生物科技有限公司，批號YM-R51811）。3）主要儀器。超凈工作臺（北京長城空氣凈化工程公司）；電子秤（長沙湘平科技發展有限公司，EPS2001）；小動物心電圖機 （北京福田電子醫療儀器有限公司，FX211）；動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司，ALC-V9）； 高速離心機 （Perkin Elmer VICTOR X5）；Multiskan MK3 酶標儀 （Thermo Fisher Scientific公司）；恒溫箱（天津泰斯特儀器有限公司，DH3600）；顯微鏡（日本尼康，Nikon Ci-S）

1.2 分組及給藥 選取心電圖正常大鼠36只，采用隨機數字表法分成假手術組、模型組、通心絡組，每組12只。通心絡組大鼠予通心絡超微粉以1.0 g/（kg·d）并溶于0.9%氯化鈉注射液2 mL灌胃，假手術組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃，分別連續灌胃1周。

1.3 模型制備 心肌缺血再灌注模型參考文獻［3］。給藥1周后。大鼠以5 mL/kg腹腔注射20%烏拉坦麻醉后，采用面罩覆蓋口鼻連接呼吸機，設定呼吸頻率80 次/min、潮氣量 15 mL/kg、呼吸比 1∶1。 胸部備皮、碘伏消毒。于大鼠左側胸壁3～4肋間縱向切開皮膚約2 cm，止血鉗鈍性分離，開胸，暴露心臟，剝離心包膜，在肺動脈圓錐與左心耳之間，左心耳下緣約2～3 mm處結扎，冠脈與結扎線之間使用5號白線隔開，假手術組只穿線，不接扎。進針深度約1～1.5 mm，寬約2.0 mm，用彎止血鉗將胸部皮膚和肌肉夾緊關閉胸腔，呼吸機維持10～15 min，待大鼠自主呼吸恢復觀察心電圖改變。造模成功標志：室壁運動減弱，結扎下部心肌組織顏色變白，心電圖可見胸前各個導聯的ST段抬高、T波高聳為。冠脈結扎1 h后，連接呼吸機，逐層打開胸腔，松開結扎線，完成再灌注。

1.4 標本采集與檢測 大鼠再灌注2 h后，采集心電圖，腹主動脈取血5 mL，摘取心臟，予4%多聚甲醛保存。HE染色：將心肌組織樣本脫水、包埋切成4 μm的薄片，常規染色，光鏡觀察。取1 mL血標本檢測血常規，高速離心機分離血清，檢測生化指標；予ELISA試劑盒分別檢測血清Syk、ERK的磷酸化水平、5-HT水平。

1.5 統計學處理 應用SPSS20．0統計軟件。所有數據均進行正態性和方差齊性檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時釆用LSD法、Dunnett法進行兩兩比較；方差不齊時，進行Welch近似方差分析，采用Tamhane’s T2法進行兩兩比較。若不服從正態分布，則進行非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心電圖改變比較 假手術組再灌2 h后與造模后比較，部分大鼠心電圖肢體導聯Ⅱ、Ⅲ、ST段輕度的抬高，Ⅱ導聯出現病理性Q波。模型組大鼠心電圖肢體導聯Ⅱ、ST段有不同程度的抬高，肢體導聯Ⅲ、T波倒置，部分大鼠再灌注后出現心律失常。通心絡組大鼠再灌2 h后，部分心電圖T波抬高回落約0.06 s，QRS波群寬大畸形的概率低于模型組，模型組大鼠再灌注后T波回落較少，部分甚至上抬。

2.2 各組大鼠心肌標本組織HE染色比較 假手術組大鼠心肌纖維大致排列規則，部分肌纖維可見嗜酸性變及心肌斷裂現象，肌核居中卵圓形或梭形，其形態及結構正常，部分心肌間質水腫及出血改變。模型組大鼠心肌纖維凝固型壞死、核碎裂、消失，胞質均質紅染或規則粗顆粒狀，間質水腫，不同程度的炎性細胞浸潤，心肌細胞核呈卵圓形或梭形，其形態及結構未見明顯異常改變，部分心肌梗死灶外圍出現充血出血帶。通心絡組大鼠部分心肌纖維凝固型壞死，胞漿嗜酸性變，可見橫紋不清，甚至消失，呈紅染均質狀，炎性細胞浸潤程度較模型組減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌標本HE染色形態學改變（HE染色，20倍）

2.3 各組大鼠血常規檢測結果比較 見表1。與模型組相較，通心絡組大鼠白細胞（WBC）數量顯著降低（P＜0.01）；假手術組大鼠 WBC 數量顯著降低（P＜0.01）。通心絡組大鼠血小板（PLT）水平與假手術組、模型組相比均降低（P＜0.05或 P＜0.01）。

2.4 各組大鼠血生化Ca2+、CK、LDH水平比較 見表2。與假手術組相比，模型組大鼠血清Ca2+、CK、LDH水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，通心絡組血清Ca2+、CK、LDH水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05或 P＜0.01）。

表1 各組大鼠血常規結果比較（109/L

表1 各組大鼠血常規結果比較（109/L

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n WBC PLT假手術組 12 7.22±1.41△△ 1102.17±124.52模型組 12 14.45±1.01* 1252.40±239.27通心絡組 12 6.26±1.36△△ 915.00±136.44**△△

表 2 各組大鼠血清 Ca2+、CK、LDH 水平比較（

表 2 各組大鼠血清 Ca2+、CK、LDH 水平比較（

組 別 n LDH（IU/L）Ca2+（mmol/L） CK（IU/L）假手術組 12 983.84±178.09△△模型組 12 1948.04±597.83**2.38±0.03△ 5330.98±223.99△2.51±0.10* 8326.95±1236.06*通心絡組 12 1235.40±271.44△2.27±0.02**△△ 4401.38±980.91△

2.5 各組血清Syk、ERK、5-HT水平比較 見表3。與假手術組相比，模型組與通心絡組大鼠的血清Syk、5-HT水平均降低，且大鼠血清ERK水平均升高（P＜0.05或P＜0.01）；通心絡組與模型組相比，大鼠血清Syk、5-HT水平顯著降低，ERK水平顯著升高（P＜0.01）。

表 3 各組大鼠血清Syk、ERK、5-HT 水平比較（pg/mL

表 3 各組大鼠血清Syk、ERK、5-HT 水平比較（pg/mL

組 別 n Syk ERK 5-HT假手術組 12 690.81±15.76△△模型組 12 857.80±83.80**1207.22±143.95△△ 2169.65±141.13△△1559.87±107.71** 1956.40±90.51**通心絡組 12 608.78±26.59**△△1100.53±127.87*△△ 2676.06±170.63**△△

3 討 論

隨著現代醫學技術的發展，一些動脈搭橋術、溶栓療法、經皮腔內冠脈血管成形術等應用于心肌缺血的治療，隨之帶來心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的發生率逐年升高，成為臨床治療的一大難題。心肌缺血再灌注的炎癥反應進一步加重心肌損傷［3］，其中肥大細胞脫顆粒介導的炎癥反應較為突出。

肥大細胞（Mast Cell）［4］廣泛分布在皮膚及內臟黏膜下的微血管周圍，存在血液中的MC，含有肝素、組織胺、5-羥色胺等，抗原刺激時，膜表面受體活化，使Syk和Fyn蛋白酪氨酸激酶活化，形成肥大細胞脫顆粒的初始信號［5］。TPS、c-Fos是主要由 MC 分泌的炎癥介質［6］，經肥大細胞脫顆粒釋放到細胞外，因其在MC的貯存和表達中具有高度選擇性，故可作為MC激活及其脫顆粒的標志［7］。肥大細胞脫顆粒反應依賴于Ca2+濃度［8］，釋放組胺、5-羥色胺等介質，激活炎癥反應，破壞胞膜線粒體等微觀結構，加重心肌損傷［9］。肥大細胞脫顆粒上游的Syk、ERK水平的變化與心肌Ca2+損傷嚴重程度相關，Syk磷酸化水平升高，MC激活脫顆粒化，加重炎癥反應［10］；研究發現抑制MC的激活，血清中ERK磷酸化水平升高，可保護受損心?。?1］。

中藥復方通心絡以“絡以通為用”的治療原則［12］，運用搜剔疏通類藥物，改善微循環；既往課題組研究發現通心絡超微粉滲灌氣血，濡養臟腑［13］，可保護血管內皮損傷，減少心梗無再流面積，減輕心肌再灌注損傷［14］；通過多途徑、多環節、多靶點影響疾病的進程，改善心肌受損嚴重程度和預后［15］。

本研究結果顯示，通心絡組大鼠心肌組織的凋亡指數，較模型組顯著降低；表明通心絡超微粉可減輕心肌細胞的凋亡； 血清中TPS、c-Fos、Syk、5-HT水平在模型組顯著升高，在通心絡組顯著降低，表明通心絡可減輕心肌損傷中的炎癥反應；血清中ERK水平在通心絡組升高，表明通心絡超微粉可促進細胞自我修復功能，綜上述通心絡超微粉可減輕心肌缺血再灌注過程中肥大細胞脫顆粒介導的炎癥反應，保護受損心肌。為臨床疾病的防治和治療有指導意義。

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Effects of Tongxinluo Decoction on Inflammatory Response Induced by Degranulation of Mast Cells in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

HUANG Ting，LI Shaodan，LI Han，et al. Beijing Uni-versity of Chinese Medicine，Beijing 100029，China.

Objective： To discuss the protective effect and mechanism of Tongxinluo Decoction on myocardial injury induced by mast cells in rats with ischemia reperfusion injury，and explore its mechanism.Methods： 36 healthy adult male SD rats were randomly divided into the sham operation group，the model group，and Tongxinluo Decoction group.Myocardial ischemia reperfusion model was established by ligation of the left anterior descending coronary artery，myocardial ischemia for 1 H，and reperfusion for 2 H；while the sham group was punctured without ligation.The rats in Tongxinluo Decoction group

intragastric administration with Tongxinluo Decoction，and the model group and the sham group were intragastric administration with saline.After 1 weeks，changes of pathological in myocardium were observed by HE staining；routine blood test，blood biochemical examination，serum Phosphorylation level of Syk and ERK and 5-HT were detected.Results：The expression of 5-HT and Syk phosphorylation levels of Tongxinluo Decoction group were significantly lower than those in the model group，and the phosphorylation level of ERK increased significantly，compared with the model group（P<0.01）.Conclusion：Tongxinluo Decoction can inhibit the inflammatory reaction induced by mast cell degranulation by reducing the phosphorylation level of 5-HT and Syk and increasing the phosphorylation level of ERK，reduce myocardial injury and then protect myocardial tissue.

Tongxinluo Decoction；Myocardial ischemia reperfusion；Mast cell degranulation；Inflammatory reaction

R285.5

A

1004-745X（2017）09-1514-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.003

2017-05-09）

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）（2012CB518601）

△通信作者（電子郵箱：ymh9651@sina.com）