蒲參膠囊對大鼠腦缺血再灌注后血清bFGF和BDNF蛋白表達的影響

朱 清 姚蓓蓓 吳明華

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029）

蒲參膠囊對大鼠腦缺血再灌注后血清bFGF和BDNF蛋白表達的影響

朱 清 姚蓓蓓 吳明華△

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029）

目的 觀察蒲參膠囊對大鼠腦缺血/再灌注后血清bFGF和BDNF蛋白表達的影響，探討蒲參膠囊促進腦缺血后神經損傷恢復的可能作用機制。方法 將健康SD大鼠隨機分成蒲參膠囊低、中、高劑量組，假手術和模型組。通過線栓法建立大鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）腦缺血再灌注模型，術后高劑量組（250 mg/200 g）、中劑量組（125 mg/200 g）、低劑量組（62.5 mg/200 g）每日予灌胃給藥1次，假手術、模型組給予生理鹽水灌胃。術后第1天、7天、14天分別對各組大鼠進行腹主動脈采血，并分離血清，用酶聯免疫吸附劑（ELISA）測定血清中bFGF和BDNF的水平。結果 與模型組相比，蒲參膠囊中劑量組第7天可明顯提高外周血bFGF和BDNF的蛋白水平。結論 蒲參膠囊在一定程度上可提高大鼠腦缺血/再灌注后血清bFGF和BDNF的表達水平，改善神經再生微環境，進而促進神經功能的修復。

蒲參膠囊 腦缺血/再灌注 bFGF BDNF

缺血性腦血管病目前已成為成人致殘的主要原因之一。雖然再灌注有益于減少缺血性損傷及恢復一些可逆性損害，但最近的研究發現，再灌注在某些情況下可能會進一步加重損傷和功能障礙，缺血/再灌注導致大量的神經元壞死，造成難以逆轉的神經系統損傷［1］。因此尋找有效的方法保護受損神經元，促進神經再生及神經損傷的修復至關重要。神經營養因子是由神經支配的組織或者膠質細胞產生、分泌的一類蛋白質，通過支持神經元的存活，促進它們的生長及分化，刺激軸突生長，促進神經再生，進而達到保護神經功能、修復大腦損傷的作用。堿性成纖維生長因子（bFGF）及腦源性神經營養因子（BDNF）是兩種重要的神經營養因子。本次實驗通過制備大鼠腦缺血/再灌注模型，給予蒲參膠囊中藥粉劑干預，通過酶聯免疫吸附劑檢測大鼠血清中bFGF和BDNF蛋白的水平，探討蒲參膠囊對促進腦缺血/再灌注后的神經損傷修復的作用及其相關機制。為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 蒲參膠囊粉劑，由蘇中藥業提供，藥物組成：何首烏、蒲黃、丹參、川芎、赤芍、山楂、澤瀉、黨參。實驗前用0.9%氯化鈉注射液溶解。ELISA試劑盒品牌，購自金益柏公司；ELx800光吸收酶標儀、ELx50微孔板全自動洗板機，購自BIOTEK公司；5424R冷凍離心機，購自Eppendorf公司；隔水室恒溫培養箱（國產）。

1.2 實驗動物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，體質量250～280 g，SPF級，共96只。由北京維通利華實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（京）2012-0001；動物合格證號11400700173737。

1.3 分組與造模 1）分組：大鼠隨機分為假手術對照組、模型組、蒲參高劑量組、蒲參中劑量組、蒲參低劑量組，每組19只。2）模型制備：動物飼養至體質量250～280 g，采用頸內動脈線栓法制備大腦中動脈阻塞（MCAO）腦缺血再灌注模型。動物用7%水合三氯乙醛（6 mL/kg）麻醉，于頸部正中切開，分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎并剪斷頸外動脈，循頸內動脈向前，結扎翼腭動脈。夾閉頸總動脈近心端，從頸外動脈的結扎線的遠端作一切口，插入外徑為0.285 mm的尼龍線，進過頸總動脈分叉進入頸內動脈，然后徐徐插入至有輕微阻力為止（自分叉處約20 mm），阻斷大腦中動脈的所有血供，右側腦缺血2 h后，輕輕拔出尼龍線，恢復血供進行再灌注。假手術組分離、暴露血管后縫合。3）模型納入標準：大鼠完全清醒后，出現右側虹膜顏色變淺，瞳孔縮小，左側偏癱（左上肢明顯），大鼠自主運動時，出現左轉圈，提尾懸空時，左前肢屈曲、內收為模型成功。如未出現上訴癥狀，予以排除。神經功能損傷評價參考改良Bederson 5分制法［2］。0分：提尾懸空時，動物的兩前肢均伸向地板方向，且無其他行為缺陷；1分：提尾懸空時，動物的手術對（左）側前肢表現為腕肘屈曲、肩內旋、肘外展、緊貼胸壁；2分：將動物置于光滑平板上，推手術側肩向對側移動時阻力降低；3分：動物自由行走時，向手術對側環行或轉圈；4分：肢體軟癱，肢體無自發活動。0分及4分者予以排除。

1.4 給藥方法 造模成功后，所有大鼠均接受每天1次灌胃給藥。蒲參膠囊成人用量為1 g，每日3次，參考動物與人體的每公斤體重劑量折算系數表［3］，得出蒲參低劑量組的給藥劑量為62.5 mg/200g，中劑量組為125 mg/200 g，高劑量組為250 mg/200 g。于再灌注后，待動物清醒后灌胃給藥1次，其后每日給藥1次，假手術對照組、模型空白對照組給按5 mL/kg灌胃0.9%氯化鈉溶液。

1.5 標本采集與檢測 第1天、第7天、第14天對各組大鼠進行腹主動脈采血，并分離血清，低溫保存。ELISA采用雙抗體夾心法測定標本中大鼠堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、腦源性神經營養因子（BDNF）水平。具體操作步驟按照bFGF和BDNF的ELISA試劑盒說明書要求進行。

1.6 統計學處理 應用SPSS16．0統計軟件。計量資料以s）表示，用秩和檢驗對進行組內比較，差異有統計學意義后進行兩兩比較，根據重復檢驗的次數重新規定檢驗水準。

2 結 果

2.1 各組bFGF水平比較 見表1。治療1 d，與模型組相比，假手術組bFGF水平明顯升高，具有統計學意義（P<0.05）。治療7 d，各組間差異有統計學意義（P<0.05）。低、中、高、假手術分別與模型組比較，確定兩兩對比的檢驗水準，α＇=0.0125，即P<0.0125差異有統計學意義：與模型組對比，低劑量組bFGF水平升高，差異無統計學意義（P>0.0125）；中劑量組bFGF水平明顯升高，差異有統計學意義 （P<0.0125）；高劑量組bFGF水平明顯降低，差異有統計學意義（P<0.0125）；假手術組bFGF水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.0125）。治療14 d，各組間差異無統計學意義 （P>0.05），不再進行兩兩比較。

表1 各組不同時期bFGF水平比較s）

表1 各組不同時期bFGF水平比較s）

1 d 7 d- 11.35±1.21- 12.02±0.56- 10.56±0.54假手術組14 d蒲參低劑量組 11.19±0.42蒲參中劑量組 11.48±1.00蒲參高劑量組 11.51±0.46組 別12.55±1.01 11.97±0.61模型組 10.50±1.91 11.30±0.20 11.81±0.79 12.07±0.96

2.2 各組BDNF水平比較 見表2。治療第1天，與模型組對比，假手術組BDNF水平升高，無統計學意義（P>0.05）。治療第7天，組間差異有統計學意義（P<0.05），再進行兩兩比較，蒲參低、中、高劑量組及假手術組分別與模型組比較，確定兩兩對比的檢驗水準，α′=0.0125，即P<0.0125差異有統計學意義：與模型組對比，蒲參低劑量組BDNF水平升高，差異無統計學意義（P>0.0125）；蒲參中劑量組BDNF水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.0125）；蒲參高劑量組BDNF水平降低，差異無統計學意義（P>0.0125）；假手術組BDNF水平升高，差異無統計學意義（P>0.0125）。治療第14天，組間差異有統計學意義（P<0.05），再進行兩兩比較，蒲參低、中、高劑量組及假手術分別與模型組比較，確定兩兩對比的檢驗水準，α′=0.0125，即P<0.0125差異有統計學意義：與模型組對比，蒲參低、高劑量組、假手術組BDNF水平降低，差異無統計學意義（P>0.0125）；蒲參中劑量組BDNF水平升高，差異無統計學意義（P>0.0125）。

表2 各組不同時期BDNF水平比較）

表2 各組不同時期BDNF水平比較）

1 d 7 d- 6 0.8 7±7.5 4- 6 2.0 9±1.5 2- 5 2.1 4±5.4 8假手術組1 4 d蒲參低劑量組 6 0.9 4±3.8 5蒲參中劑量組 6 6.3 4±3.0 3蒲參高劑量組 6 1.3 5±3.2 1組 別6 1.7 9±7.4 6 5 7.9 9±2.3 6模型組 5 6.6 9±1 0.2 6 5 2.9 9±4.6 0 6 2.3 1±8.5 5 5 7.6 5±2.9 8

3 討 論

缺血性腦血管病屬于中醫學“中風”的范疇，中風的發生常由“風、火、痰、氣、虛”引起，而與血瘀關系尤為密切，于瀟等［4-5］認為血瘀是中風發病的關鍵，貫穿中風病始終，且夾瘀夾虛者居多。現代醫學也證實［6］，缺血性中風的發病，血液流變學檢查一般表現為血液黏稠度增高、血液流動緩慢、血液動力學障礙等特點，與血瘀特征相似。因此血瘀是導致中風的重要因素，活血祛瘀法是中風病的治療大法。蒲參膠囊為臨床用于治療高脂血癥的血瘀證，具有活血祛瘀，滋陰化濁的功效，根據中醫的“異病同治”觀點，蒲參膠囊的作用特點也可用于治療中風的血瘀證，蒲參膠囊由何首烏、蒲黃、丹參、川芎、赤芍、山楂、澤瀉、黨參組成。何首烏補肝腎、益精血，蒲黃化瘀行血通經，丹參、川芎、赤芍、山楂均有活血祛瘀之功，澤瀉利水滲濕，可瀉水濕，行痰飲，黨參補氣補血生津，諸藥合用，可行活血祛瘀，滋陰化濁之功，痰濁、瘀血祛，則血脈通暢，氣機條達，滋補陰液，則新血得以化生，舊血祛，新血生，血脈暢，腦絡得以濡養，則可促進組織損傷的恢復。

bFGF屬于成纖維細胞生長因子（FGF）家族中的一員，它在中樞神經系統中廣泛分布，在生理狀態下，bFGF很難通過血腦屏障，但腦缺血缺氧造成局部血腦屏障損傷后，通透性增加，它可通過病變組織進入到外周血中［7］。bFGF不僅直接營養神經元，還可促進神經干細胞的增殖、分化從而促進受損神經組織的恢復。bFGF可與細胞膜表面的相應受體結合發揮神經保護作用，可能的作用機制涉及促進血管生成、減少神經細胞凋亡、減少興奮性氨基酸毒、維持細胞內Ca2+的穩定性和抗氧自由基的損害［8-10］。

BDNF廣泛分布于中樞神經系統中，其中以海馬和皮層組織中含量最高。BDNF不僅在中樞系統發育過程中對神經元的生存、分化、發育和維持其正常功能表達上起關鍵作用，還可促進神經元損傷后的再生修復，防止神經元受損死亡。Mamounas等［11］證實，緩慢注入BDNF浸潤腦組織可顯著刺激大鼠腦內新皮質區和海馬內受神經毒素PCA損傷的軸突發芽，可見BDNF對神經損傷及神經再生具有其獨特的作用，但也依賴其他因子的協調作用。BDNF通過與其特異性受體結合而發揮生物學作用，TrKB是BDNF高親和力受體，BDNF與TrKB受體結合同時激活絲裂原活化蛋白激酶、磷酯酰肌醇3激酶和磷脂酶C-γ等信號通路［12］。通過激活的信號通路發揮促進神經元生存，增加突觸可塑性及神經發生的作用。BDNF還具有抑制腦缺血后的各種損傷機制的作用：如減輕鈣離子的超載、抗氧自由基損傷、抑制谷氨酸毒性等［13-15］。從而保護腦缺血后受損神經元，促進大腦損傷的恢復。

本實驗研究發現蒲參膠囊中劑量組在治療7 d時可明顯提高bFGF及BDNF蛋白的水平。治療14 d，蒲參膠囊低劑量組與治療第7天時相比，對bFGF、BDNF的水平無明顯影響；而中劑量組和高劑量組均有升高，但與模型組比較無顯著差異。說明蒲參膠囊在一定程度上可以刺激神經營養因子的分泌，保護受損神經元，促進神經再生，從而促進腦缺血/再灌注后神經損傷的修復，但其量效關系還需進一步驗證。

因此，通過對中風病的病因病機及中藥藥物組成療效的分析，結合本次實驗研究的結果，為蒲參膠囊治療缺血性中風的可行性及促進神經損傷的修復提供了一定的依據。

［1］Duehrkop C，Rieben R.Ischemia/reperfusion injury： effect of simultaneous inhibition of plasma cascade systems versus specific complement inhibition［J］.Biochem Pharmacol，2014，88（1）：12-22.

［2］Menzies SA，Hoff JT，Betz AL.Middle cerebral artery occlusion in rats：a neurological and pathological evaluation of a reproducible model［J］.Neurosurgery，1992，31（1）：106-107.

［3］施新猷.醫用實驗動物學［M］.西安：陜西科學技術出版社，1989：382.

［4］于瀟，周鴻飛.中風病從血瘀論治探析［J］.遼寧中醫藥大學學報，2013，24（11）：252-253.

［5］王立超，吳明華.通腦飲治療急性腦梗死臨床研究［J］.中國中醫急癥，2015，24（11）：1929-1931.

［6］向詩余，曾強.活血化瘀藥防治缺血性中風進展［J］.中國中醫急癥，2002，11（3）：213-214.

［7］Ren JM，Finklestein SP.Time window of infarct reduction by intravenous basic fibroblast growth factor in focal cerebral ischemia［J］.Eur J Pharmacol，1997，327（1）：11-16.

［8］Akimoto T，Hammerman MR.Fibroblast growth factor 2 promotes microvessel formation from mouse embryonic aorta［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2003，284（2）：C371-377.

［9］Wang Z，Zhang H，Xu X，et al.bFGF inhibits ER stress induced by ischemic oxidative injury via activation of the PI3K/Akt and ERK1/2 pathways［J］.Toxicol Lett，2012，212（2）：137-146.

［10］Noshita T，Murayama N，Oka T，et al.Effect of bFGF on neuronal damage induced by sequential treatment of amyloid β and excitatory amino acid in vitro and in vivo［J］.Eur J Pharmacol，2012，695（1-3）：76-82.

［11］Mamounas LA，Altar CA，Blue ME，et al.BDNF promotes the regenerative sprouting， but not survival， of injured serotonergic axons in the adult rat brain［J］.J Neurosci，2000，20（2）：771-782.

［12］Yoshii A，Constantine-Paton M.Postsynaptic BDNF-TrkB signaling in synapse maturation， plasticity， and disease［J］.Dev Neurobiol，2010，70（5）：304-322.

［13］Han BH，D'Costa A，Back SA，et al.BDNF blocks caspase-3 activation in neonatal hypoxia-ischemia［J］.Neurobiol Dis，2000，7（1）：38-53.

［14］Mattson MP，Lovell MA，Furukawa K，et al.Neurotrophic factors attenuate glutamate-induced accumulation of peroxides，elevation of intracellular Ca2+concentration，and neurotoxicity and increase antioxidant enzyme activities in hippocampal neurons［J］.J Neurochem，1995，65（4）：1740-1751.

［15］Wu CL，Hwang CS，Yang DI.Protective effects of brain-derived neurotrophic factor against neurotoxicity of 3-nitropropionic acid in rat cortical neurons［J］.Neurotoxicology，2009，30（4）：718-726.

R285.5

A

1004-745X（2017）09-1599-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.029

2017-03-21）

△通信作者（電子郵箱：mhuawu@163.com）