涼粉草DNA條形碼通用序列的篩選及其混偽品分子鑒定

魏星任+葉清蓮+馬新業+龍潔怡+張嬌+嚴萍+詹若挺+陳蔚文

摘要：提取涼粉草基因組總DNA，使用通用引物擴增核基因ITS1、ITS2序列和葉綠體psbA-trnH、rbcL、matK序列并進行測序，使用CodonCode Aligner軟件對完整序列進行拼接并對其進行比對，使用MEGA 7.0鄰接法（neighbor-joining，NJ）法構建系統聚類樹。結果表明，matK序列擴增成功率低；ITS1序列存在單一變異位點且測序成功率低；ITS2、rbcL和psbA-trnH等3個序列無變異位點，序列擴增成功率、測序成功率高，序列長度在233～671 bp，從系統聚類樹上得出ITS2序列可以將涼粉草與其他3種混偽品區分開，而rbcL和psbA-trnH序列在區分時存在一定的混淆。ITS2序列可以考慮作為鑒別涼粉草的優選序列。

關鍵詞：涼粉草；DNA條形碼；分子鑒定；ITS2；混偽品

中圖分類號： R282.710.3文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0032-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2017-01-25

基金項目：廣東省高等院校學科與專業建設專項（編號：2013CXZDA011）；廣東省普通高校創新團隊項目（編號：2016KYTD02）；廣東省大學生創新創業訓練計劃（編號：201610572099）。

作者簡介：魏星任（1993—），女，廣東揭陽人，碩士研究生，研究方向為中藥質量標準。E-mail：524344346@qq.com。

通信作者：嚴萍，博士，副研究員，研究方向為中藥質量標準。E-mail：yanping@gzucm.edu.cn。

[ZK）]

涼粉草（Mesona chinensis）為唇形科（Labiatae）涼粉草屬（Mesona）植物，別稱仙人草、仙草、仙人凍、薪草，是一類重要的經濟和藥用植物，全世界有8～10種，零星分布于印度東北部、東南亞及我國東南各省的廣大地區[1]。在我國，主要分布于福建、臺灣、浙江、廣東、廣西及云南等地。據《全國中草藥匯編》記載，仙草性味澀、甘、寒，具清暑解渴、涼血解暑及利尿之功效[2]，主治中暑，小兒酢皰、丹毒入腹、消渴、感冒、高血壓、黃疸、腎臟病、糖尿病和關節肌肉疼痛等。

長期以來，涼粉草以野生資源為主，不同地區的資源在長期進化過程中形成了在外部形態特征甚至內部的生理結構上的極大差異。隨著用量的不斷提升，涼粉草的種質資源問題得到了重視，分子標記是資源鑒定與評價有的效方法之一。關杰敏等得到了一種適合涼粉草基因組DNA的提取方法，能提供高質量的涼粉草總DNA[3]。李曉暉等表明，SCoT和ISSR等2種分子標記均適用于涼粉草種質資源的遺傳多樣性研究[4-5]。DNA條形碼是一種特異性的分子鑒定技術，Chen等經過大樣本量研究，證明DNA條形碼應用于植物分子鑒定非常高的穩定性和準確度[6-12]，2015版《中國藥典》第三部規定DNA條形碼植物類藥材鑒定以核糖體ITS2作為主體條形碼，并以psbA-trnH為輔進行[13]。目前涼粉草的DNA條形碼方面研究也只涉及單一序列ITS2，本研究選取了廣東省、廣西壯族自治區、福建省、臺灣、江西省等地的涼粉草為樣本，基本涵蓋絕大部分涼粉草產地，并選用了核基因ITS1、ITS2序列和葉綠體基因rbcL、psbA-trnH和matK序列作為候選序列，旨在通過更多的涼粉草樣本來優選出合適的候選片段作為DNA條形碼鑒定該植物的序列。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗選取涼粉草26份，涼粉草樣品試驗號MB-01～MB-10采集自廣州中醫藥大學2號山體（藥王山），為各地移栽品種；MB-11～MB-26由廣東南嶺藥業股份有限公司提供（詳見表1）。試驗標本經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室講師林穎鑒定，憑證標本保存于廣州中醫藥大學中藥科學與工程研究中心。KM280868、FJ513094為Genbank上獲得的涼粉草登錄號。混偽品樣本序列17份，均在Genbank上下載，其材料信息見表2。涉及涼粉草常見的混偽物種：線紋香茶菜（Isodon lophanthoides Buch. -Ham. ex D. Don H. Hara）、溪黃草（Isodon serra Maxim. Hara）和筋骨草（Ajuga ciliate Bunge）。

1.2儀器與試劑

所用儀器有BS224S型電子分析天平（德國賽多利斯公司），MJ-Mini型PCR儀（BioRad），DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像儀（法國VL），微量紫外分光光度計（北京天根有限公司），Milipore-Q型純水儀（Millipore公司）。

試劑有DP321植物基因組DNA提取試劑盒、MD109 100 bp DNA ladder（北京天根有限公司）、DRR 100B Ex Taq（TaKaRa），ITS1、ITS2、rbcL、psbA-trnH引物（華大基因科技有限公司）。

1.3方法

1.3.1DNA提取將采集到的新鮮樣品用75%乙醇洗凈表面，置于烘箱中40 ℃烘干，稱取樣品30 mg加入液氮中充分碾磨。按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作并用微量紫外分光光度計測定提取的DNA濃度及純度。

1.3.2聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，簡稱PCR）擴增及測序本試驗所用引物序列及PCR條件見表3。PCR體系包括1.0 μL上、下游引物，1.0 μL基因組DNA，12.5 μL Taq酶，用ddH2O補充到25 μL；PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳并送華大基因科技有限公司完成雙向測序。

1.3.3序列分析使用CodonCode Aligner V6.0.2對測序峰圖進行校對拼接，去除低質量序列及引物區的序列，使用DNAMAN 8.0進行多序列比對；使用MEGA 7.0對試驗樣本所得基因序列構建系統進化樹，評價不同候選序列ITS2、rbcL和psbA-trnH對涼粉草的鑒定能力。endprint

2結果與分析

[HTK]2.1序列長度、葡萄糖含量和變異分析[HT]

ITS1、ITS2、psbA-trnH、rbcL序列電泳圖條帶清晰，無雜帶，擴增成功率為96%，matK反復試驗均擴增成功率低（圖1）。ITS2、psbA-trnH、rbcL的測序成功率為100%，ITS1測序成功率為68%，遠低于前三者的成功率，且ITS1存在2個變異位點，所以在本研究中ITS1、matK不作為推薦的優選序列。

[FL（2K2]由表4可知，不同的3條候選序列在序列長度、GC含量方面有較明顯的差異。序列長度由高到低依次為rbcL、psbA-trnH、ITS2，GC含量從高到低依次為ITS2、rbcL、psbA-trnH。3條候選序列均無變異位點。

2.2不同候選序列對涼粉草及其混偽品的鑒定能力

采用NJ法構建不同序列的系統聚類樹，利用Bootstrap法1 000次重復檢驗各分支的支持率，NJ樹構建結果見圖2。結果表明，ITS2序列能將所有的樣品聚為兩大支，其中涼粉草單獨成一支，具有明顯的單系性，然后與筋骨草聚為一大支，同時線紋香茶菜及其變種與溪黃草組成另外一大支；rbcL序列將所有的樣品聚成兩大支，涼粉草與筋骨草成為一大支，然而不能與其他混偽品形成的另一大支區分開；psbA-trnH序列涼粉草單獨成支，然而無法與線紋香茶菜及其變種區分開。所以只有ITS2序列能夠將涼粉草與其混偽品線紋香茶菜、溪黃草和筋骨草區分開，其他2個序列則無法完全區分。

3小結

本試驗采用5條通用的候選DNA條形碼序列對26個不同產地涼粉草樣品及其混偽品進行對比研究。matK序列是葉綠體DNA中進化的比較快的序列，但是在涼粉草中很難成功擴增；ITS1的測序效率較低只有68%且存在2個變異位點；psbA-trnH、RbcL序列不能完全把涼粉草與本研究所用到的混偽品區分開；只有ITS2序列有較高的擴增效率和測序效率且能準確鑒別涼粉草與其他3種混偽品。所以建議優先選擇ITS2序列作為鑒別涼粉草的DNA條形碼的基因序列。

[FK（W20][TPWXR2.tif][FK）]

DNA的ITS序列，結果顯示ITS序列在ITS1區段的第355位和ITS2區段的第578位存在2個堿基的差異[14]，與本研究結果有所不同，可能是試驗收集樣本不相同導致的。同時與師玉華等的結黃玉吉等通過克隆測序法測定了涼粉草不同品系核糖體論即ITS2序列能夠鑒別涼茶藥材涼粉草溪黃草、[JP3]斷血流和筋骨草[15]相符合，本研究相對于馬定乾等的研究的先進之處在于對熱門通用序列進行了篩選，[JP2]驗證了候選序列對于涼粉草的適用性和鑒別能力，所以得出的結論更加客觀、全面。[JP]

本研究所涉及的混偽品數據全部來源于GenBank，且網上涼粉草混偽品相關數據較少，所以今后的研究中考慮增加混偽品試驗樣本數量。本研究雖然具有一定的不足，但仍然對涼粉草的分子鑒定有參考意義。[HT][FL）]

[KH*4D]

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