子癇前期產婦胎盤組織miR-30家族miRNA及其下游基因表達變化

許敏，李燕，李惠梅，許金環，呂述彥

(南京醫科大學附屬淮安第一醫院,江蘇淮安223300)

子癇前期產婦胎盤組織miR-30家族miRNA及其下游基因表達變化

許敏，李燕，李惠梅，許金環，呂述彥

(南京醫科大學附屬淮安第一醫院,江蘇淮安223300)

目的觀察子癇前期產婦胎盤組織miR-30家族miRNA(miR-30a-5p、 miR-30a-3p、miR-30b、 miR-30d、miR-30e-3p)及其下游基因表達變化。方法選取26例子癇前期產婦為觀察組，38例健康產婦為對照組，均采用剖宮產分娩，取其胎盤組織。用實時熒光定量PCR法檢測兩組產婦胎盤miR-30a-5p、 miR-30a-3p、miR-30b、 miR-30d、miR-30e-3p及其下游靶基因(用生物信息學網站Target Scan預測)的表達。結果觀察組產婦胎盤組織miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d、miR-30e-3p表達量分別為1.08±0.69、0.61±0.39、0.77±0.68、1.86±1.87、0.39±0.22，對照組分別為0.97±0.47、0.33±0.25、0.30±0.23、2.72±1.55、0.25±0.20。觀察組miR-30a-3p、miR-30b、miR-30e-3p、miR-30d表達量與對照組相比P均<0.05。生物學信息分析發現CCNT2、ZFAT是miR30家族miRNA的下游基因。觀察組胎盤組織CCNT2、ZFAT mRNA表達量分別為0.40±0.24、0.16±0.11，對照組分別為0.14±0.13、0.09±0.05。兩組胎盤組織CCNT2、ZFAT mRNA表達量相比，P均<0.05。結論子癇前期產婦胎盤組織miR-30家族miR-30a-3p、miR-30b、miR-30e-3p表達升高，miR-30d表達降低，其下游靶基因CCNT2、ZFAT表達升高。

微小RNA；微小RNA30；CCNT2基因；ZFAT基因；妊娠并發癥；子癇前期；胎盤

子癇前期(PE)是妊娠20周后出現的特發性妊娠期綜合征，以初發高血壓及蛋白尿為主要特征。PE的全球發病率約占2%～8%，是導致孕、產婦死亡的重要原因[1]。胎盤缺血缺氧、血管內皮損傷、免疫等多種因素導致滋養細胞功能障礙、胎盤灌注不足，進而引起胎盤功能異常是PE發生發展的主要原因。小RNA(miRNA)通過抑制mRNA翻譯或誘導其降解在轉錄后水平發揮調控基因表達的作用。有研究[2]發現miR-155通過下調CYR61參與PE的發生發展。我們前期通過miRNA芯片篩檢了PE相關的miRNA表達，發現部分miR-30家族miRNA(miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p)在PE產婦與正常產婦胎盤中的表達存在差異，推測部分miR-30家族的miRNA表達失衡可能與PE發病相關。但是芯片篩檢結果只能發現表達差異的miRNA，不能做到定量檢測。本研究觀察了PE產婦胎盤中部分miR-30家族miRNA(miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p)及其下游靶基因(用生物信息學方法預測)的表達變化，探討miR-30家族在PE發病機制中的作用。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年1月～2011年12月在我院正規產檢、分娩的產婦PE產婦26例為PE組，健康產婦38例為對照組。PE組年齡(29.88±6.15)歲，24 h尿蛋白(0.47±0.49)g，孕齡(37±2)周，收縮壓(151.85±7.20)mmHg，舒張壓(85.15±8.37)mmHg。對照組年齡(27.34±4.37)歲，孕齡(37±1)周，收縮壓(121.42±6.96)mmHg，舒張壓(70.92±6.36)mmHg。兩組產婦年齡、孕周相比P均>0.05。分娩方式均為剖宮產。PE定義為妊娠20周后出現收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg伴24h蛋白尿≥0.3 g或隨機尿蛋白(+)。所有產婦血小板、肝功能、腎功能和胎兒體質量都位于正常范圍。所有產婦的血壓及尿蛋白在產后6周內均恢復了正常。 剔除患有慢性高血壓、慢性腎臟疾病、凝血功能障礙、胎膜早破和其他妊娠綜合征如胎兒染色體異常的患者。本研究已獲得本院倫理委員會的批準，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 miR-30家族miRNA下游基因的生物信息學分析方法 利用生物信息學網站TargetScan(http://www.targetscan.org)進行miR-30家族miRNA下游基因預測，方法參照網站說明。

1.3 兩組產婦胎盤組織miR-30家族miRNA及下游基因表達檢測 兩組產婦產后半小時內收集胎盤母體面中央的絨毛組織置于液氮中-80°保存。產婦用Tiozol試劑按說明書操作提取包括microRNA在內的總RNA。用實時熒光定量PCR法檢測兩組產婦胎盤組織中miR-30家族miRNA(miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p)及其下游基因CCNT2、ZFAT。miR-30家族miRNA檢測以U6作為內參，引物見表1。PCR過程：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃30 s。CCNT2、ZFAT mRNA用GAPDH作為內參，PCR過程為，37 ℃15 min，85 ℃30 s。上述操作在ABI 7900HT測序儀上完成，用SDS2.4軟件計算每個循環的閾值(Ct)，以2-ΔΔCt表示各目的基因表達量。

表1 實時熒光定量PCR所用的引物序列

2 結果

觀察組產婦胎盤組織miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d、miR-30e-3p表達量分別為1.08±0.69、0.61±0.39、0.77±0.68、1.86±1.87、0.39±0.22，對照組分別為0.97±0.47、0.33±0.25、0.30±0.23、2.72±1.55、0.25±0.20。兩組miR-30a-3p、miR-30b、miR-30e-3p、miR-30d表達量相比P均<0.05,兩組miR-30a-5p表達量相比P>0.05。

生物學信息分析發現CCNT2、ZFAT是miR30家族miRNA的下游基因。觀察組胎盤組織CCNT2、ZFAT mRNA表達量分別為0.40±0.24、0.16±0.11，對照組分別為0.14±0.13、0.09±0.05。兩組胎盤組織CCNT2、ZFAT mRNA表達量相比P均<0.05。

3 討論

miRNA在真核生物體內普遍存在，其長度約9～22個核苷酸，由60～110核苷酸的內源性轉錄前體經過Drosha酶和Dicer酶加工而成。miRNA通過與目標mRNA的3′端非編碼區(3′-UTR區)的完全或不完全配對引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯，通過對基因進行轉錄后表達的調控[3]在細胞增殖、分化以及凋亡等生物過程中發揮重要的調控作用。miRNA有進化高度保守、組織特異性表達、表達時序性等生物學特性。同一miRNA可位于染色體的同一部位共同發揮調控作用，也稱基因的簇集性[4]。目前miRNA的研究并不深入，miRNA的染色體定位、與靶基因的作用通路、對組織的調控機制尚不清楚。

PE是由多種因素導致的妊娠期特異性并發癥，嚴重者可導致產婦子癇、肺水腫及腎衰，胎兒生長受限和腦癱[5]，是導致孕、產婦和新生兒死亡的重要原因[6]。子癇前期的發病機制復雜，目前認為子癇前期的發展分為兩個階段。妊娠早期階段：在胎盤形成時，血液灌注不足、免疫耐受等多種因素共同導致滋養細胞侵襲不足，螺旋動脈重鑄障礙，胎盤缺血缺氧；妊娠晚期階段：氧化應激、炎癥等因素致使胎盤合成大量因子(如IL-1)，引起母體血管內皮功能紊亂，各器官內皮細胞功能障礙，全身小血管痙攣，繼而引發子癇前期的一系列臨床癥狀。有研究顯示發育不良的胎盤中存在多種異常表達的miRNA，胎盤組織中普遍表達以及病理情況下特殊存在的miRNA能夠調節滋養細胞功能以及血管生成，可能與PE發生發展有關。有學者發現miR-29b可誘導滋養層細胞凋亡[7]，另有研究表明miR-155可調控PE患者的血管緊張素受體[8]。然而，miRNA促進PE發生發展的確切機制目前仍不清楚。本研究結果顯示PE產婦胎盤中miR-30a-3p、miR-30b和miR-30e-3p表達升高，miR-30d表達降低。

細胞周期由不同時期組成，從G1、S、G2到M期，細胞周期的改變會導致增殖性疾病和腫瘤的發生。CDK家族通過與細胞周期蛋白結合，控制細胞周期。活化和調節支持細胞分裂，并參與轉錄過程調控[9]。轉錄延長促進因子P-TEFb是轉錄必需的細胞因子[10]，CDK9與CCNT2[7]形成異二聚體后活化P-TEFb。活化后的P-TEFb具有廣泛的生物活性，包括細胞周期調控、細胞因子轉導[11]，并與轉錄調控因子協同調控啟動子區的轉錄[12]。有學者發現，CDK9通過使RNA聚合酶Ⅱ的C端(CTD)磷酸化，調控細胞的轉錄延長[13]。本研究結果顯示CCNT2在PE患者胎盤中表達明顯升高，且生物學信息分析認為CCNT2是miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p的下游靶基因。推測差異表達的miR-30家族的miRNA可能是通過CCNT2途徑通過調控細胞周期影響細胞的轉錄及胎盤發育。

ZFAT是具有AT鉤和鋅指結構域的核蛋白。ZFAT在人類相關疾病的發生發展中起重要作用[14]，有研究報道ZFAT的遺傳變異與橋本病[15]、高血壓病[16]、腦動脈瘤的發生及上皮性卵巢癌細胞相關[17]。還有學者通過染色質免疫沉淀的方法發現ZFAT主要分布在轉錄起始位點(TSS)周圍，在該位點敲除ZFAT，H3K9ac/K27ac水平降低，表明H3K9ac/K27ac調控與ZFAT有關，并可能是ZFAT在T細胞中發揮重要作用的生物基礎[18]。本研究結果顯示PE患者胎盤中ZFAT顯著高表達，為首次發現。生物信息學研究結果顯示，ZFAT可能是miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p的下游基因，miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p可能通過ZFAT參與PE的發生發展過程。

綜上所述，miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d、miR-30e-3p及其下游基因CCNT2、ZFAT在PE患者胎盤中表達升高，他們可能相互作用共同促進了PE的發生發展，但具體的作用關系仍需進一步研究。后續我們將進一步擴大樣本量，并對差異表達的miRNA和靶基因的關系進行驗證，或增加細胞學、蛋白質等層面的研究，進一步探討差異表達的miR-30家族miRNA在PE發生發展中發揮的具體作用。

[1] 許敏;呂述彥.血管生成相關mirnas與子癇前期[J].實用醫學雜志，2015，31(6):1026-1028.

[2] Zhang Y, Diao Z, Su L, et al. Microrna-155 contributes to preeclampsia by down-regulating cyr61[J]. Am J Obstet Gynecol，2010,202(5):461-467.

[3] Zhang Y, Fei M, Xue G, et al. Elevated levels of hypoxia-inducible microrna-210 in pre-eclampsia: New insights into molecular mechanisms for the disease[J]. J Cell Mol Med，2012,16(2):249-259.

[4] 蔣濤濤,孫波,沈梅,等. miRNA在重度子癇前期與正常妊娠胎盤組織中差異表達的研究[J]. 中國實驗診斷學,2015,19(10):1707-1710.

[5] Strand KM, Heimstad R, Iversen AC, et al. Mediators of the association between pre-eclampsia and cerebral palsy: Population based cohort study[J]. BMJ，2013,34(7):4089.

[6] Mol BW, Roberts CT, Thangaratinam S, et al. Pre-eclampsia[J].Lancet，2016,387(10022):999-1011.

[7] Wu N, Wu GC, Hu R, et al. Ginsenoside rh2 inhibits glioma cell proliferation by targeting microrna-128[J]. Acta Pharmacol Sin，2011,32(3):345-353.

[8] Orrenius S.Reactive oxygen species in mitochondria-mediated cell death[J].Drug Metab Rev，2007,39(2-3):443-455.

[9] Hussain A, Verma CK, Chouhan U. Identification of novel inhibitors against cyclin dependent kinase 9/cyclin t1 complex as: Anti cancer agent[J]. Saudi J Biol Sci，2017,24(6):1229-1242.

[10] Peng J, Marshall NF, Price DH.Identification of a cyclin subunit required for the function of drosophila p-tefb[J].J Biol Chem，2008，273(22):13855-13860.

[11] Grana X, Deluca A, Sang NY, et al. Pitalre, a nuclear cdc2-related protein kinase that phosphorylates the retinoblastoma protein in vitro[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2014，91(9):3834-3838.

[12] Wang Q, Young TM, Mathews MB, et al. Developmental regulators containing the i-mfa domain interact with t cyclins and tat and modulate transcription[J]. J Mol Biol，2007,367(3):630-646.

[13] Narita T, Ishida T, Ito A, et al. Cyclin-dependent kinase 9 is a novel specific molecular target in adult t-cell leukemia/lymphoma[J]. Blood，2017,130(9):1114-1124.

[14] Doi K, Ishikura S, Shirasawa S. The roles of zfat in thymocyte differentiation and homeostasis of peripheral naive t-cells[J]. Anticancer Res，2014,34(8):4489-4495.

[15] Inoue N, Watanabe M, Yamada H, et al. Associations between autoimmune thyroid disease prognosis and functional polymorphisms of susceptibility genes, ctla4, ptpn22, cd40, fcrl3, and zfat, previously revealed in genome-wide association studies[J]. J Clin Immunol，2012，32(6):1243-1252.

[16] Slavin TP, Feng T, Schnell A, et al. Two-marker association tests yield new disease associations for coronary artery disease and hypertension[J]. Hum Genet，2011,130(6):725-733.

[17] Ramakrishna M, Williams LH, Boyle SE, et al.Identification of candidate growth promoting genes in ovarian cancer through integrated copy number and expression analysis[J]. PLoS One，2010,5(4):9983.

[18] Ishikura S, Tsunoda T, Nakabayashi K, et al. Molecular mechanisms of transcriptional regulation by the nuclear zinc-finger protein zfat in t cells[J]. Biochem Biophys Acta，2016,1859(11):1398-1410.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.020

R714.25

B

1002-266X(2017)35-0061-03

2017-02-26)

江蘇省婦幼保健科研項目(F201430)。

呂述彥(E-mail: sysky803@aliyun.com)