急性白血病患兒骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2的表達及其與病灶髓外浸潤和預后的關系

鄭轉珍,李國霞,張耀方,徐麗娟,朱鐳

(1山西醫科大學第二臨床醫學院，太原030001；2 山西省婦幼保健院)

急性白血病患兒骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2的表達及其與病灶髓外浸潤和預后的關系

鄭轉珍1,李國霞1,張耀方1,徐麗娟1,朱鐳2

(1山西醫科大學第二臨床醫學院，太原030001；2山西省婦幼保健院)

目的觀察急性白血病(AL)患兒 骨髓單個核細胞中CAMP反應元件型結合因子(CREB)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2) mRNA和蛋白的表達變化，并探討其與AL患兒髓外浸潤、預后的關系。方法選擇2015年2月～2017年3月收治的96例AL患兒，其中急性淋巴細胞白血病(ALL)61例為ALL組，急性髓細胞白血病(AML)35例為對照組，另取骨髓穿刺排除白血病的其他血液病患兒35例為對照組。均行骨髓穿刺抽取骨髓組織分離單個核細胞，用實時熒光定量PCR法測算其中CREB、Bcl-2 mRNA相對表達量，用Western blotting法測算其中CREB、Bcl-2 蛋白相對表達量，并進行組間比較。將ALL、AML組患兒按是否存在髓外浸潤分為髓外浸潤亞組和無髓外浸潤亞組，按化療后是否緩解分為緩解亞組和未緩解亞組，比較各亞組CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量。結果ALL、AML組骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。ALL組和AML組骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量相比，P均>0.05。ALL、AML組中有髓外浸潤亞組患兒骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量均高于各自的無髓外浸潤亞組(P均<0.05)。ALL、AML組中緩解亞組患兒骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量均高于各自的未緩解亞組(P均<0.05)。結論AL患兒骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白高表達，且表達量與髓外浸潤和患兒預后有關。

急性白血病；急性淋巴細胞白血病；急性髓細胞白血病；骨髓；單個核細胞；CAMP反應元件結合蛋白；B淋巴細胞瘤-2

急性白血病(AL)作為多發于兒童時期的一類常見的血液性惡性腫瘤，對患兒的生命安全具有較大的威脅。該病發病機制不明確，復發率高，髓外浸潤多見，影響長期生存，治療難度較大。尋找AL的相關基因并用其輔助AL診治具有重要的臨床意義[1]。CAMP反應元件結合蛋白(CREB)屬于核轉錄調節因子，有利于細胞的存活與增殖，還可對細胞凋亡產生抑制，參與正常機體的造血功能及慢性白血病的發生發展[2]，但其與AL的關系尚不明確。B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)屬于凋亡抑制基因，其同惡性腫瘤的形成緊密相關[3，4]，但Bcl-2與AL關系的相關研究相對較少。本研究觀察了AL患兒骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達變化，并探討其與AL患兒髓外浸潤、預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年2月～2017年3月收治的96例AL患兒。入選標準：①患兒均經骨髓穿刺病例活檢確診；②年齡<14歲；③初診的患兒。排除標準：①其他類型的惡性血液性疾病；②繼發于其他惡性腫瘤者；③有嚴重的心、肝、腎等臟器的功能性不全者。其中急性淋巴細胞白血病(ALL)61例，為ALL組。ALL組男32例、女29例，年齡3～12(6.24±1.07)歲。B細胞型20例，T細胞型41例。有髓外浸潤46例，無髓外浸潤15例。均采用標準VDLP方案(長春新堿+柔紅霉素+潑尼松+左旋門冬酰胺酶)治療1個月，緩解(完全緩解+部分緩解)48例，未緩解13例。急性髓細胞白血病(AML)35例為AML組。男22例、女13例，年齡4～13(6.27±1.12)歲。M1型7例，M2型19例，M4型6例，M5型3例。有髓外浸潤27例，無髓外浸潤8例。均采用DAE方案(柔紅霉素+阿糖胞苷+VP16)治療1個月，緩解24例，未緩解11例。另選同期收治的骨髓穿刺排除白血病的35例血液病患兒為對照組。男25例、女10例，年齡3～12(6.25±1.09)歲。其中感染性疾病15例，缺鐵型貧血14例，血小板減少型紫癜6例。各組患兒性別、年齡等一般資料相比P均>0.05。本研究的內容和方法已經我院醫學倫理委員會批準，患兒監護人均簽署知情同意書。

1.2 各組患兒骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2 mRNA檢測 取各組患兒骨髓穿刺所得骨髓組織，用天津浩洋公司生產的Ficoll液分離單個核細胞，采用實時熒光定量PCR法測算其中CREB、Bcl-2 mRNA相對表達量。先用購于美國MBI公司的RNA提取試劑盒對細胞的RNA進行提取，操作過程應嚴格遵照說明書的步驟施行。然后行實時熒光定量PCR，試劑盒購自美國MBI公司，操作按試劑盒說明書進行。CREB引物序列：正向5′-GACTTTCTCCGGAACTCA-3′，反向5′-CGGTACCATTGCTAGCCAG-3′，擴增片段長度312 bp。Bcl-2引物序列：正向5′-CGCTTTGCCACGGTGGTGGAG-3′，反向5′-GTACATCACTGACAATGC-3′，擴增片段長度415 bp。內參照β-actin引物序列：正向5′-TTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTC-3′，反向5′-GTCGGATTGATGAAACCCAGACACA-3′，擴增片段長度168 bp。PCR反應條件為94 ℃ 5 min，64 ℃1 min，后退火(其中CREB為55 ℃，Bcl-2為60 ℃，β-actin為50 ℃)約1 min，72 ℃ 2 min，72 ℃ 5 min，共40個循環。將10μL的PCR產物放于20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統分析，用2-ΔΔCt表示CREB、Bcl-2 mRNA相對表達量。

1.3 各組患兒骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2 蛋白檢測 采用Western blotting法。取按1.2方法分離的骨髓單個核細胞，加入細胞裂解液裂解，心收集蛋白，用Western blotting法檢測CREB、Bcl-2 蛋白相對表達量。操作按試劑盒說明書進行。CREB、Bcl-2 蛋白相對表達量以CREB、Bcl-2 蛋白條帶與內參照GADPH條帶灰度值的比值表示。

2 結果

2.1 各組骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2mRNA及蛋白相對表達量比較 各組骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2mRNA及蛋白相對表達量見表1。ALL、AML組骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。ALL組和AML組骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量相比,P均>0.05。

表1 各組患兒骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2的mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2 有、無髓外浸潤亞組患兒骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量比較 ALL、AML組中有、無髓外浸潤亞組患兒骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量見表2。ALL、AML組中有髓外浸潤亞組患兒骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量均高于各自的無髓外浸潤亞組(P均<0.05)。

表2 有、無髓外浸潤亞組患兒骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2的mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與無髓外浸潤組相比，*P<0.05。

2.3 緩解、未緩解亞組患兒骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量比較 ALL、AML組中緩解、未緩解亞組患兒骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量見表3。ALL、AML組中緩解亞組患兒骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量均高于各自的未緩解亞組(P均<0.05)。

表3 緩解、未緩解亞組患兒骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2的mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與未緩解組相比，*P<0.05。

3 討論

骨髓細胞基因轉錄主要受轉錄因子的調控[5]。CREB屬于CREB/ATF-1這一重要轉錄因子家族的成員。在多類癌癥中均已發現CREB處于高表達狀態。Bcl-2蛋白由Bcl-2原癌基因編碼，其高表達可以促進癌細胞存活。有報道指出[6～8]，AL的發病機制主要是增殖失控、分化障礙和細胞凋亡抑制。造血細胞的非正常惡性增殖及凋亡受抑也與患者預后有關[9～11]。為進一步明確CREB、Bcl-2與AL的關系，我們觀察了AL患兒骨髓單個核細胞CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達變化，并探討其與AL患兒髓外浸潤、預后的關系。結果顯示ALL、AML組患兒骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量高于對照組，ALL、AML組間比較差異無統計學意義。這與文川等[12～14]的報道結果類似，提示無論是ALL還是AML，患兒骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達均上升。分析原因，主要可能與CREB和Bcl-2在癌細胞中的作用機制及白血病的發病機制有關。CREB的高表達則可能是通過某種信號通路對Bcl-2在白血病的有關發病進程中的表達進行上調而實現的。換言之，CREB及Bcl-2的高表達均可能是ALL及AML的部分發病共同機制，因此二者在ALL組和AML組中的表達水平均明顯上升。本研究還發現，ALL、AML患兒髓外浸潤亞組骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量均高于各自的無髓外浸潤亞組。這提示了CREB及Bcl-2在有髓外浸潤的白血病患兒中更易表現出高表達狀態。原因可能是因為髓外浸潤易使病情進展，終使二者均呈現出高表達。此外，ALL、AML組緩解亞組骨髓單個核細胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量均高于未緩解亞組。這提示了經過相應的治療后，癥狀緩解的白血病患兒骨髓細胞中CREB和Bcl-2的表達明顯下調。原因可能是因為化療藥物的作用殺死了部分癌細胞，阻斷了白血病有關細胞的異常增殖過程，最終干擾了CREB和Bcl-2在細胞中的表達，并使二者均下調[15]。

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山西省科技攻關項目(20120313020-6)。