番茄葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因cab—1a的克隆與定位

朱彬彬　崔百明　向本春

摘要：在進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯Y病毒HC-Pro蛋白與番茄未知蛋白發(fā)生相互作用，經(jīng)測序、Blast比對，確認(rèn)其為番茄葉綠素a/b結(jié)合蛋白Cab-1A，Genebank序列號(hào)為XM_010318610.1。為初步驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)引物，然后以番茄cDNA文庫為模板，克隆出798 bp的cab-1a全長序列，并構(gòu)建了cab-1a基因的亞細(xì)胞定位載體pSPGFP-Cab-1A，并運(yùn)用葉盤法將其轉(zhuǎn)化到煙草表皮細(xì)胞中，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察其定位情況。結(jié)果表明，cab-1a基因編碼的Cab-1A-like蛋白位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，為與馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）蛋白HC-Pro（helper component proteinase）相互作用的后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番茄；葉綠素a/b；蛋白Cab-1A；亞細(xì)胞定位；GFP；煙草表皮細(xì)胞

中圖分類號(hào)： S641.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）14-0020-04

光合作用是地球上生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)，高等植物光合作用光能的捕獲與傳遞主要是通過光捕獲葉綠素a/b結(jié)合蛋白（chlorophyll a/b binding protein，Cab）來完成[1]，在高等植物中大部分葉綠素分子都結(jié)合在光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的天然色素蛋白復(fù)合物上[2]。這些蛋白復(fù)合物共同組成一個(gè)很重要而又很龐大的家族，但特點(diǎn)又不是很明顯。光捕獲葉綠素a/b結(jié)合蛋白Cab是一類能捕獲光能，并把光能轉(zhuǎn)化成電能迅速傳至光反應(yīng)中心引起光化學(xué)反應(yīng)的色素蛋白，這些蛋白復(fù)合體由屬于同一家族的色素結(jié)合蛋白與色素結(jié)合而形成，然后通過色素結(jié)合蛋白的跨膜區(qū)將其錨定在類囊體膜上。高等植物中大部分的葉綠素分子都結(jié)合在PSⅠ、PSⅡ的捕光色素蛋白復(fù)合物上，其中PSⅡ捕光色素蛋白復(fù)合物結(jié)合的葉綠素約占類囊體膜上色素量的50%[3]，除與光能的傳遞相關(guān)之外，其在響應(yīng)外界生物脅迫方面也發(fā)揮著重要作用[4-5]，且隨著電子晶體學(xué)研究方法的發(fā)展，對Cab蛋白晶體結(jié)構(gòu)的分析也日趨深入[6]。

葉綠素a/b結(jié)合蛋白由定位于細(xì)胞核內(nèi)的cab基因編碼[7]，核基因cab轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA在細(xì)胞質(zhì)的80 S核糖體上翻譯合成前體多肽，這些前體多肽被運(yùn)進(jìn)葉綠體并被加工切割成成熟蛋白，其轉(zhuǎn)移過程借助于被稱為過渡肽（transit peptide）或引導(dǎo)肽（leader peptide）的N末端擴(kuò)展序列。過渡肽和切割位點(diǎn)下游6—15氨基酸殘基區(qū)域是Cab蛋白前體的多變區(qū)[8]。

番茄中，目前為止已報(bào)道的Cab蛋白有21種[9]，其中Cab-1A為高等植物中的主要光捕獲蛋白之一，別稱 LHCb1-1。本研究對光捕獲葉綠素a/b結(jié)合蛋白Cab-1A進(jìn)行定位，結(jié)合對與PVY HC-Pro相互作用的研究，以期為探索葉綠素a/b結(jié)合蛋白的新功能奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

大腸桿菌（Escherchia coil）DH5α、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefacieas）GV3101以及各個(gè)載體骨架均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存提供。

限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、ClaⅠ、SalⅠ、KpnⅠ、SmaⅠ均購自于賽默飛世爾科技（中國）有限公司。EcoR Ⅰ、T4 DNA ligase、pGEM-T Esay Vector、Wizard DNA clean-up凝膠回收試劑盒等購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司。DNA MarkerⅢ、Marker DL15000+2000均購自于天根生化科技（北京）有限公司。

從加工番茄（Solanum lycopersicum）里格爾87-5中提取的cDNA、試驗(yàn)所用本氏煙草種子均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1加工番茄cab-1a基因克隆

以加工番茄里格爾 87-5 cDNA為模板，根據(jù)已報(bào)道的序列[10]，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物（表1），PCR克隆得到cab-1a基因片段。將PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段進(jìn)行凝膠電泳檢測，并對檢測到的目的基因片段運(yùn)用試劑盒進(jìn)行凝膠回收，進(jìn)而連接到T載體 pGEM-Easy Vector上，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2Cab-1A-like蛋白的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用 ExPASy 程序（http：//www.expasy.org）進(jìn)行氨基酸序列生物信息學(xué)分析[11]；假定蛋白質(zhì)的多重比對和進(jìn)化樹分析在Vector NTI 11.5進(jìn)行；跨膜區(qū)域和構(gòu)向預(yù)測在TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html）中進(jìn)行；通過HNN二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_hnn.html）推定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；三級(jí)結(jié)構(gòu)模型建立使用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）程序。

1.2.3亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物GFP-S/GFP-AS（表1），從pCBGFP：35S-GAi載體上克隆得到綠色熒光蛋白基因GFP序列，經(jīng)XmaⅠ/SacⅠ雙酶切后，凝膠電泳檢測并回收目的片段GFP，然后將酶切后的GFP片段連接到同樣酶切的雙元載體pSPYCE：35S上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，將構(gòu)建好的N端定位載體骨架pSPGFP：35S送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。然后將目的基因cab-1a從T載體上酶切下來，連接到N端定位載體上，構(gòu)建最終定位載體pSPGFP-Cab-1A（圖1），并以pSPGFP載體骨架作為對照，酶切鑒定并測序。endprint

1.2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片遺傳轉(zhuǎn)化

將測序正確的目標(biāo)載體運(yùn)用電擊法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，克隆PCR，挑取陽性克隆，接種到10 mL的LB液體培養(yǎng)基中（含有相應(yīng)的抗生素），28 ℃孵育24 h以上，之后在28 ℃、190 r/min搖床振蕩至培養(yǎng)基D600 nm為0.6～1.0。將培養(yǎng)液以3 000 g、4 ℃ 離心15 min，收集農(nóng)桿菌GV3101沉淀。棄廢液，向沉淀顆粒中加入新鮮的滲透液[12]（MgCl2 10 mmol/L，MES/KOH 10 mmol/L，pH值5.7，乙酰丁香酮150 μmol/L），使最終懸浮液D600 nm為0.5左右。將含有農(nóng)桿菌細(xì)胞的滲透液在搖床中黑暗孵育2 h，然后用于滲透。

取3周大煙草（本氏煙）植株的頂3葉，采用葉盤法進(jìn)行組織培養(yǎng)。從組織培養(yǎng)后的葉組織上切取1～2 cm2 的小塊置于滲透液中，并于100 r/min搖床上振蕩滲透10 min。用滅菌的濾紙吸干表面菌液，置于MS預(yù)培養(yǎng)基上，暗處室溫下培養(yǎng) 2 d。2 d后置于共培養(yǎng)MS培養(yǎng)基（含相應(yīng)抗生素）上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，2周更換1次培養(yǎng)基，直至長出2 cm小芽，然后轉(zhuǎn)入MS生根培養(yǎng)基，室溫下進(jìn)行生根，生根2周后進(jìn)行熒光檢測。

取轉(zhuǎn)化后的植株葉片置于載玻片上，滴幾滴清水，蓋上蓋玻片，在共聚焦熒光掃描顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2.1序列比對

番茄cab-1a目的基因的假定蛋白Cab-1A-like序列分別與NCBI公布的cab1a、cab1b、cab1c、cab3a、cab3c、cab6a基因的蛋白序列進(jìn)行比對分析，相似度達(dá)到95%以上（圖2），表明克隆的目的基因就是cab-1a，屬于Cab家族成員。Cab-1C進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖3）表明，番茄Cab-1A-like蛋白與Cab-1C的親緣關(guān)系更近，而與NCBI上預(yù)測的Cab-1A蛋白不屬于同一分支，這可能與此蛋白是由假定推測得到的相關(guān)，而且與Cab-3C的相似度最低。

2.2生物信息學(xué)預(yù)測分析

從加工番茄cDNA中擴(kuò)增出約700 bp的目的條帶，測序分析結(jié)果表明，cab-1a基因ORF長798 bp，預(yù)測可以編碼1個(gè)含有265個(gè)氨基酸的多肽序列。用NCBI CDS對該多肽進(jìn)行分析，結(jié)果表明，加工番茄Cab-1A-like蛋白具有葉綠素a/b結(jié)合蛋白家族結(jié)構(gòu)域，屬于該家族成員（圖4）。

用iPSORT（http：//ipsort.hgc.jp/）序列分析表明，番茄的Cab-1A-like蛋白N端有1個(gè)潛在的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（MAAATMALSSPSFAGQAVKLSPSASEISGN）。

此外，ExPASy（http：//web.expasy.org/peptide_mass/）對其預(yù)測結(jié)果表明，Cab-1A-like蛋白分子量約是 28.07 ku，等電點(diǎn)（PI）為5.51，保守序列約占92.1%。對Cab-1A二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果表明，其有3個(gè)跨膜螺旋，且有35.09% α-螺旋、8.68% β-折疊、56.2%的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。

三級(jí)結(jié)構(gòu)模型用Swiss Model（http：//swissmodel.expasy.org/templates/1rwt.1）進(jìn)行預(yù)測，其空間結(jié)構(gòu)與菠菜（SMTL id：1rwt.1）的Cab蛋白有95.65%相似度。

2.3亞細(xì)胞定位載體的鑒定

取菌落PCR陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA，并根據(jù)所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行XbaⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定，獲得1條約800 bp的條帶，該條帶為目的基因cab-1a（圖5），與預(yù)期相符，對酶切正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果表明，構(gòu)建的亞細(xì)胞定位載體是正確的。

2.4熒光檢測

將雙元表達(dá)載體pSPGFP-Cab-1A運(yùn)用電擊法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，用克隆PCR鑒定正確的菌株侵染本氏煙表皮細(xì)胞48 h，激光共聚焦顯微鏡下觀察到綠色熒光分布在煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核膜和細(xì)胞質(zhì)上，并且細(xì)胞核上的熒光比細(xì)胞質(zhì)的熒光要強(qiáng)（圖6）。

3結(jié)論與討論

cab基因家族在長期進(jìn)化過程中，cDNA序列是相當(dāng)保守的[13]。同樣的，番茄cab-1a基因作為LhcbI類基因成員[10]，其對應(yīng)的蛋白序列與其他幾個(gè)Cab基因蛋白序列的一致性在85%以上，進(jìn)一步證明此基因在進(jìn)化過程中是相對保守的。但是，由cab-1基因與cab-3基因編碼的多肽相比，轉(zhuǎn)運(yùn)肽和N末端的結(jié)構(gòu)域有明顯差別，而其余部分的序列基本是相同的。因?yàn)閏ab基因編碼的葉綠素a/b結(jié)合蛋白最終定位在葉綠體類囊體膜上，所以這段引導(dǎo)肽對其至關(guān)重要，由于這類蛋白的引導(dǎo)肽多位于蛋白序列的N端，所以，本研究只是將GFP蛋白序列添加到了其C端，不影響其正確的定位。

此外，本研究對Cab-1A-like蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，其位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，細(xì)胞質(zhì)中的蛋白屬于葉綠體內(nèi)定位的蛋白或者是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上正在加工的不成熟蛋白；對于細(xì)胞核上的定位，大多位于細(xì)胞核核膜上，本研究猜測這可能是由于該蛋白引導(dǎo)肽與某個(gè)蛋白的核定位信號(hào)序列結(jié)構(gòu)相似所致。

植物在長期進(jìn)化過程中，不斷抵御外部傷害，包括有害生物的入侵，其體內(nèi)逐漸形成了一套完整的保護(hù)機(jī)制[14-15]，無論是針對細(xì)菌還是病毒，植物能抵抗絕大多數(shù)微生物的侵染，主要是因?yàn)橹参锛?xì)胞具有識(shí)別微生物保守分子模式的受體，這些受體能把胞外信號(hào)傳遞到胞內(nèi)，觸發(fā)植物的先天免疫反應(yīng)。病原物在與植物的長期互作過程中進(jìn)化出效應(yīng)蛋白，這些效應(yīng)蛋白能夠抑制植物的先天免疫反應(yīng)，從而使病原物可以成功地侵染特定的植物[16]。本研究在前期進(jìn)行的酵母雙雜交試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，Cab-1A-like蛋白與馬鈴薯Y病毒HC-Pro蛋白相互作用，由于酵母雙雜交系統(tǒng)的篩選存在假陽性結(jié)果[17-18]，使得本研究有必要對該蛋白作出進(jìn)一步深層次的分子鑒定，為后續(xù)驗(yàn)證該蛋白質(zhì)與馬鈴薯Y病毒蛋白相互作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。endprint

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