苦豆子愈傷組織誘導及細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立

高媛　孫牧笛　徐全智

摘要：以苦豆子子葉和胚軸為材料，對苦豆子愈傷組織誘導和繼代增殖的最佳培養(yǎng)條件進行研究，旨在建立苦豆子懸浮細胞體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子葉和胚軸為愈傷組織生成的最佳外植體，愈傷組織最佳誘導培養(yǎng)基是MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；最佳繼代增殖培養(yǎng)基是MS+1.0 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D。以胚軸誘導的愈傷組織是細胞懸浮培養(yǎng)的理想材料，初始接種量10%～20%，添加3%蔗糖，有利于懸浮細胞體系的生成。

關(guān)鍵詞：苦豆子；愈傷組織；懸浮培養(yǎng)；子葉；胚軸；誘導培養(yǎng)基；繼代增殖培養(yǎng)基；初始接種量

中圖分類號： S567.904.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0027-04

苦豆子（Sophora alopecuroides）豆科槐屬，是我國西北荒漠區(qū)廣泛分布的一種重要沙生藥用植物[1]，以全草、根、種子入藥，味極苦，性寒，民間用其根治喉痛、咳嗽、痢疾及濕疹等[2]。喹諾里西啶生物堿和類黃酮是其重要的活性成分，已有研究報道，喹諾里西啶生物堿是一種安全無毒的生物殺蟲劑，在醫(yī)藥上苦豆子具有清熱解毒、祛風燥濕、止痛殺蟲、增強免疫等多種生理活性[3]。通過刈割苦豆子植株提取有效活性物質(zhì)是目前常用的方法，但苦豆子野生資源有限，且不利于人工栽培，勢必造成野生資源枯竭，影響生態(tài)平衡[4]。因此，合理開發(fā)利用苦豆子資源是其長足發(fā)展的重要途徑。

植物細胞懸浮培養(yǎng)是指將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。目前，利用懸浮細胞培養(yǎng)來生產(chǎn)次生代謝物已廣泛應用于各類藥用植物中。1997年，許建鋒等首次開展了高山紅景天懸浮細胞培養(yǎng)[5]。2010年，姜新超對岷江百合進行愈傷組織的誘導時發(fā)現(xiàn)，懸浮細胞系建立的關(guān)鍵在于挑選適于懸浮細胞培養(yǎng)的愈傷組織[6]。2014年，趙繼鵬等建立了曼地亞紅豆杉細胞懸浮體系，發(fā)現(xiàn)接種量和激素配比起著至關(guān)重要的作用[7]。迄今為止，國內(nèi)外有關(guān)藥用植物懸浮細胞培養(yǎng)方面的研究越來越多，紅豆杉、甘草、半夏等都有相關(guān)的報道[8-10]。關(guān)于苦豆子愈傷組織培養(yǎng)已有大量報道，但暫無人建立苦豆子懸浮細胞系。本研究以苦豆子發(fā)芽籽粒的子葉、胚軸和胚根為外植體，研究苦豆子愈傷組織誘導、繼代增殖培養(yǎng)條件，建立苦豆子懸浮細胞培養(yǎng)體系，為進一步研究苦豆子懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

野生苦豆子豆莢采自寧夏靈武白芨灘國家自然保護區(qū)。

1.2方法

1.2.1愈傷組織誘導培養(yǎng)

1.2.1.1不同外植體對愈傷組織誘導的影響

挑選飽滿、無病害蟲蛀的苦豆子種子，80%硫酸浸泡2 h軟化種皮，無菌水沖洗并浸泡2 h。用體積分數(shù)為75%的乙醇消毒1 min，無菌水沖洗3次，5%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，無菌水沖洗3次，置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，溫度為（25±2） ℃，暗培養(yǎng)24 h后，光周期為12 h/d，培養(yǎng)3～5 d催芽。將子葉、胚軸和胚根用滅菌刀劃上切口后，接種于添加激素（0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D）的MS培養(yǎng)基上誘導愈傷組織。每種處理接種60塊外植體，上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計愈傷組織的誘導率，觀察愈傷組織的生長狀況。愈傷組織誘導率=誘導愈傷組織數(shù)/接種組織數(shù)×100%。

1.2.1.2不同激素配比對苦豆子愈傷組織誘導的影響

將子葉和胚軸分別接種于添加2，4-D（0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.1、05、1.0 mg/L）組成的26種MS培養(yǎng)基上，每個處理接種60塊外植體，在溫度為（25±2） ℃、光照時間12 h/d條件下培養(yǎng)25 d，統(tǒng)計愈傷組織的誘導率及其生長狀況。

1.2.2愈傷組織的增殖培養(yǎng)

將生長旺盛的愈傷組織轉(zhuǎn)接至添加2，4-D（0.2、0.5、1.0 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L）組成的7種MS培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，計算愈傷組織的增殖系數(shù)并記錄愈傷組織的生長狀態(tài)。增殖系數(shù)=收獲鮮質(zhì)量/接種鮮質(zhì)量。

1.2.3懸浮細胞系的建立

選用子葉誘導增殖培養(yǎng)4次的愈傷組織和胚軸誘導生成的愈傷組織，接種于含有“1.2.2”節(jié)篩選出的最佳激素配比的MS液體培養(yǎng)基中，100 mL錐形瓶中加入30 mL MS液體培養(yǎng)基，置110 r/min的恒溫搖床上，在溫度（25±1） ℃下黑暗培養(yǎng)12 h后，光照黑暗交替 12 h/d。每隔5 d繼代1次，吸取約10 mL的培養(yǎng)物，接種到新鮮培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)2～3代，得到懸浮細胞。

1.2.3.1初始接種量對懸浮細胞系的影響

以胚軸誘導的愈傷組織為懸浮細胞系材料，按不同梯度接種量接種至添加最佳激素配比的MS液體培養(yǎng)基中，7 d后收獲觀察懸浮細胞的生長情況。

1.2.3.2不同濃度抗氧化劑對懸浮細胞系的影響

以胚軸誘導的愈傷組織為懸浮細胞系材料，分別添加質(zhì)量濃度10、30、50 mg/mL的蔗糖以及10、20 mg/mL的維生素C，7 d后收獲觀察懸浮細胞的生長情況。

1.2.4懸浮細胞系生長量的測定

接種0.3 g懸浮細胞于培養(yǎng)液體積為30 mL的100 mL錐形瓶中，每2 d取樣1次，每次取3瓶，將懸浮細胞培養(yǎng)液倒入布氏漏斗減壓抽濾，抽干水分測定鮮質(zhì)量，連續(xù)測定7次繪制生長曲線。

1.2.5懸浮細胞系pH值的測定endprint

每2 d取1次懸浮細胞培養(yǎng)液，用pH計測量其酸堿度的變化，并繪制pH曲線。

1.2.6懸浮細胞系蔗糖含量的測定

利用硫酸蒽酮法測定懸浮細胞系蔗糖含量，蔗糖標準曲線y=0.007 7x+0.024 4（r2=0996 5），線性關(guān)系良好。

2結(jié)果與分析

2.1不同外植體對愈傷組織誘導的影響

以子葉為外植體的誘導率高達88.3%，生長狀態(tài)良好，愈傷組織呈嫩綠色，表面松軟結(jié)構(gòu)緊實；其次，以胚軸為外植體的誘導率為83.3%，組織膨大疏松，顏色淺綠或淡黃；以胚根為外植體的誘導率僅為23.3%，生長速度慢，分化困難，不易進行增殖培養(yǎng)（表1）。

2.2不同激素配比對愈傷組織誘導的影響

NAA在苦豆子愈傷組織的誘導上起著重要作用，未添加NAA的愈傷組織生長情況并不理想，僅在子葉切口邊緣長出愈傷組織，一般質(zhì)地較硬，誘導效果不理想。添加0.1～0.5 mg/L NAA、1.5～2.0 mg/L 6-BA、0.5～1.0 mg/L 2，4-D，對苦豆子子葉愈傷組織的誘導效果較好，誘導率相對較高，說明NAA、6-BA、2，4-D激素組合容易誘導出愈傷組織。從誘導率及愈傷組織的形態(tài)和生長狀況綜合來看，誘導子葉愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，愈傷組織表面松軟，質(zhì)地緊實，呈淡綠色（表2）。此外，用上述培養(yǎng)基進行胚軸愈傷組織的誘導，誘導率高達100%，為質(zhì)地疏松的淡黃色愈傷組織。

2.3愈傷組織的增殖培養(yǎng)

2，4-D在愈傷組織增殖生長過程中起著重要作用，未添加2，4-D的愈傷組織嚴重褐化。當6-BA濃度為 4.0 mg/L、2，4-D濃度為1.0 mg/L、NAA濃度為1.0 mg/L時，愈傷組織的繼代增殖系數(shù)達到2.4，愈傷組織質(zhì)地疏松、顏色淡綠。從愈傷組織的形態(tài)、生長狀況和增殖系數(shù)綜合來看，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA（表3）。

2.4懸浮細胞系的建立

以胚軸愈傷組織為材料（圖1-A1），在MS+1.0 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)后4 d起，培養(yǎng)液逐漸開始渾濁，呈現(xiàn)淡黃色黏稠狀（圖1-A2），鏡檢可觀察到分散的細胞及正在分裂的細胞團（圖1-A3）；而以子葉愈傷組織為材料培養(yǎng)懸浮細胞，前3 d細胞保持鮮綠色，7 d后懸浮細胞逐漸褐化死亡并聚集下沉。

2.4.1初始接種量對懸浮細胞系的影響

接種量為4.77 g時，7 d后懸浮細胞系凈生長量最高達5.24 g，且懸浮細胞培養(yǎng)液自2 d起開始出現(xiàn)渾濁，逐漸變?yōu)榈S色黏稠液體，顯微鏡檢可以觀察到大量分散性良好的細胞；其次為接種量 3.31 g，懸浮細胞系凈生長量達3.59 g；接種量分別為1.62、7.53 g 時，懸浮細胞凈生長量均較低（表4）。可見，當接種量在10%～20%時，有利于懸浮細胞體系的生成。

2.4.2不同濃度抗氧化劑對懸浮細胞系的影響

添加維生素C可在短時間內(nèi)保持懸浮細胞系的鮮活狀態(tài)，但會抑制其生長分化；添加10～50 mg/mL的蔗糖在一定程度上能防止懸浮細胞褐化，其中添加30 mg/mL的蔗糖效果最好，懸浮細胞系凈生長量達 2.59 g（表5）。

2.5懸浮細胞系的生長特征

培養(yǎng)前2 d細胞鮮質(zhì)量變化不明顯，有一定延遲期。接種后3 d細胞迅速生長，8 d時細胞鮮質(zhì)量達最大值，與培養(yǎng)初期相比增長約3倍，細胞生長進入穩(wěn)定期（圖2）。

2.6懸浮細胞系pH值的變化

苦豆子懸浮細胞在培養(yǎng)的前2 d，pH值較初始值有明顯的下降，由5.6降至5.35，隨著培養(yǎng)時間的延長，pH基本保持在5.3～5.5之間（圖3）。

2.7懸浮細胞系糖含量的變化

懸浮細胞培養(yǎng)液中總糖濃度在培養(yǎng)前2 d出現(xiàn)急劇下降趨勢， 由30 mg/mL降至10 mg/mL左右，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液中的蔗糖逐漸減少，10 d后消耗殆盡（圖4）。

3討論與結(jié)論

在植物離體培養(yǎng)過程中，外植體的內(nèi)源激素不斷發(fā)生變化，向培養(yǎng)基中添加不同種類和濃度的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以改變外植體的激素水平， 從而影響外植體的生長狀況。基本培養(yǎng)基類型、外植體種類、激素水平等均影響著愈傷組織的誘導，其中激素水平對愈傷組織誘導的影響最為復雜[11]。本試驗在已有研究基礎(chǔ)上，開展了不同激素種類及配比對苦豆子愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)的影響，并建立苦豆子懸浮細胞培養(yǎng)體系。苦豆子子葉和胚軸均適合誘導生成愈傷組織，以 MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D激素配比效果最佳，其細胞組織狀態(tài)及長勢最好。在苦豆子愈傷組織誘導過程中，NAA是必不可少的，添加適量的NAA能促進細胞分裂與生長，誘導愈傷組織效果明顯，但濃度不宜過高。一般情況下進行愈傷組織繼代培養(yǎng)時，采用與誘導培養(yǎng)基即可使愈傷組織大量增殖，但也有研究指出繼代培養(yǎng)須要適當調(diào)整激素配比，才能保證愈傷組織的增殖和生長[12]。本試驗發(fā)現(xiàn)，2，4-D和6-BA在苦豆子愈傷組織繼代培養(yǎng)中起著重要的作用，如不添加2，4-D愈傷組織容易褐化死亡，這可能與2，4-D和6-BA能有效加快植物細胞生長、延緩蛋白質(zhì)和葉綠素降解相關(guān)[13]。本試驗以MS+1.0 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D激素配比的愈傷組織繼代增殖效果最好，愈傷組織生長旺盛，顏色為黃綠色，質(zhì)地疏松，易分散。

建立良好的懸浮細胞培養(yǎng)體系是進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)的必要準備，愈傷組織良好的松散性、較強的增殖和再生能力是細胞懸浮培養(yǎng)的前提條件。本試驗采用苦豆子胚軸誘導愈傷組織，在誘導當代獲得結(jié)構(gòu)松散、單細胞比例高、分散性好的愈傷組織在MS+1.0 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后2 d起，培養(yǎng)液開始渾濁，培養(yǎng)后4 d呈現(xiàn)淡黃色黏稠狀，生長培養(yǎng)后8 d即可獲得穩(wěn)定的懸浮細胞系。這與徐世千等關(guān)于百里香懸浮細胞系研究的報道[12]相似。初始接種量是懸浮細胞培養(yǎng)過程中的重要指標，合適的細胞起始濃度，有利于相鄰細胞的信號分子量在短時間達到細胞生長的需求。初始密度過高，細胞的快速生長會大量消耗培養(yǎng)基中的養(yǎng)分，導致細胞過早衰老，褐化死亡。初始濃度過低不利于細胞間信號傳遞，從而抑制細胞生長[14]。在進行苦豆子細胞懸浮培養(yǎng)過程中，初始接種量控制在10%～20%間，均可以獲得較為穩(wěn)定的懸浮細胞系。防褐化試劑可以有效抑制細胞的褐化，延長細胞的生長周期，且一些防褐化試劑可以促進細胞的生長和次生代謝物含量的提高[15]。蔗糖是細胞生長的重要碳源，適宜濃度的蔗糖能提高培養(yǎng)細胞的生長速率并防止褐化。在苦豆子細胞懸浮系培養(yǎng)中添加30 mg/mL蔗糖，有利于苦豆子細胞生物量增加并降低褐化率。苦豆子懸浮細胞的生長周期較短，約為10 d，液體培養(yǎng)基的pH值和蔗糖含量呈現(xiàn)一定的波動，生長前期pH值明顯下降，可能與植物細胞快速吸收培養(yǎng)液中的氮素有關(guān)，pH值的下降為水解酶提供了適宜的環(huán)境[16]，使細胞充分水解培養(yǎng)液中的糖分，為細胞的生長和代謝提供能量。endprint

本試驗通過對苦豆子愈傷組織的誘導及起始細胞密度和培養(yǎng)周期對細胞懸浮培養(yǎng)影響的研究，初步建立了苦豆子細胞懸浮培養(yǎng)體系，要獲得更高產(chǎn)喹諾里西啶生物堿的苦豆子懸浮細胞系，碳源濃度、培養(yǎng)基成分及誘導前體等將是進一步試驗要考慮的重要因素。

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