藍莓莖尖脫毒繁育技術的建立

龐敏　黃科　劉奕清

摘要：分別采用細菌16S rRNA、真菌rDNA-ITS通用引物對藍莓莖尖脫毒苗基因組DNA進行擴增，結果表明，細菌16S rRNA、真菌rDNA-ITS序列擴增結果均為陰性；Trizol提取藍莓莖尖脫毒苗RNA用于病毒衣殼蛋白基因擴增，結果均為陰性；莖尖脫毒藍莓經離體快繁，增殖系數可達5。

關鍵詞：藍莓；莖尖脫毒；擴增；繁殖系數

中圖分類號： S663.904+.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0031-03

藍莓為杜鵑花科藍莓屬（Vaccinium spp.） 小灌木水果，因所含花青素生理活性好于其他植物且具特色保健功能而風靡全球。我國從20世紀80年代開始引種栽培藍莓，由于其病害發生率高且嚴重而導致減產[1]。引起藍莓發病主要的真菌性病原有葡萄座腔菌科真菌Neofusicoccum parvum 和N. austral、細極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、炭疽病菌 （Colletotrichum）、棒狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）等[2-6]，能引起藍莓葉片或枝條發病，使藍莓葉片出現不規則壞死斑點，斑點邊緣為棕褐色、棕紅色或黑色，枝頂芽枯萎、死亡或主干枯萎等；藍莓主要病毒病害有藍莓枯焦病毒（blueberry scorch virus，BLScV）、藍莓急性壞死病毒（blueberry shock virus，BLShV）[7]。另外，藍莓還受藍莓根瘤病的危害[8]。

傳統的藍莓繁育方式為分株、扦插等，不僅耗時、耗工，而且種苗不均一、攜帶病原，而通過植物分生組織或愈傷組織育苗可去除植物中已感染的病毒[9]。因此，本研究建立藍莓莖尖脫毒繁育技術，一方面可去除其致病病原物，另一方面可為藍莓生產提供“種源可靠，數量充足”的良種，以滿足藍莓迅猛發展之需。

1材料與方法

1.1試驗材料

“夏普藍”（sharpblue）藍莓，由重慶市天沛農業科技有限公司種質資源圃提供，選取2012年春季新生無病蟲害、生長健壯的幼嫩新梢作為外植體。植物激素玉米素（Zeatin，ZT），購自Sigama化學試劑中國代理公司；DNA聚合酶，購于 Promega 公司；DNA基因組試劑盒，購于Omega公司；擴增引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2外植體的誘導

將采集到的外植體剪除葉片，剪成5～6 cm莖段，用清水洗凈；超凈工作臺上用0.1% HgCl2溶液消毒3 min，置于無菌水中浸泡3～5 min，用無菌水清洗3～5次；切成帶1～2個葉腋的莖段，接種于添加3 mg/L ZT的CQWL培養基上培養，培養條件為溫度（25±2） ℃，光照度30～50 μmol/（m2·s）、光照10 h/d；誘導幼芽連續培養2代，每代時間約為30 d，轉至添加1.5 mg/L ZT的CQWL培養基上，每瓶接種無菌芽6株，連續繼代培養3代。

1.3莖尖剝離與增殖

將叢生不定芽從基部單個分離，并自芽基部以上0.5 cm左右處切斷；解剖鏡下用無菌解剖刀小心逐層剝離外層葉鞘，直至露出長0.3～0.5 mm的莖尖；用未使用過的無菌解剖刀將莖尖從母體材料上切下，立即接種于莖尖伸長誘導培養基中，（25±1） ℃、光照強度10～20 μmol/（m2·s）、光照 12 h/d 條件下進行培養， 將獲得的不定芽接種到添加 1.5 mg/L[KG*2/3]ZT的CQWL培養基進行增殖培養。經3次檢測的脫毒藍莓苗按同樣方法進行增殖。

1.4再生植株RT-PCR快速檢測

1.4.1脫細菌與真菌檢測利用DNA基因組試劑盒提取經莖尖脫毒的藍莓組培苗及培養基中可能存在的細菌基因組DNA。稱取0.3 g組培苗的根，液氮研磨，將粉末轉移至預熱A液，渦旋振蕩器振蕩，稱取0.3 g培養基于預熱A液中充分溶化，65 ℃水浴至少5 min；13 000 r/min離心5 min；取 350 μL 上清液至離心管中，加入等體積的溶液B充分混勻，冰浴 5 min，13 000 r/min室溫離心5 min；上清液轉移至 1.5 mL 離心管中，加入200 μL氯仿，振蕩30 s，13 000 r/min室溫離心5 min；上清液轉移至新的離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，混勻，15 000 r/min離心10 min；棄上清液，加入1 mL 75%乙醇洗滌，干燥，產物加入20 μL TE緩沖液溶解。

采用16S rRNA通用引物F：5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′、R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′[10]，以提取物為基因組DNA模板，進行16S rRNA擴增；采用真菌核糖體基因轉錄間隔區通用引物 ITS1：5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3′、ITS2：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[6]對病原菌基因組DNA進行PCR擴增。擴增體系為：ddH2O 17.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL，引物各0.5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL，Taq酶 0.5 μL，總DNA 1 μL。反應條件為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，采用紫外分光光度計檢測。

1.4.2脫病毒檢測分別取0.5 g藍莓組培苗的根和莖段，放入用液氮預冷的研缽中，加入液氮快速磨成粉末狀；轉移至1.5 mL無核糖核酸內切酶（RNase）的離心管中，按0.1 g組織樣品加入1 000 μL TRIzol的量添加Trizol，充分搖勻，室溫放置10 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min；取上清液至 1.5 mL 離心管，加氯仿200 μL，輕輕搖勻，靜置5 min，10 000 r/min、4 ℃ 離心10 min；取上清液至1.5 mL離心管，加2倍體積異丙醇，輕輕搖勻，靜置10 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min；棄上清液，加75%乙醇1 000 μL，洗滌提取物，干燥；用50 μL 焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解提取物，電泳檢測。分別用藍莓枯焦病毒衣殼蛋白基因V1：5′-TGTGTC AAACAATATGGC-3′、V2：5′-GCATTTCGATGATTGCGG-3′[11]，藍莓急性壞死病毒衣殼蛋白基因（GenBank：KF031042.1）設計引物V3：5′-ATGACGTCAATGGCTTCCGCAC-3′、V4：5′-CTAACCTAACGTGCTTGAAGTTC-3′ 和反轉錄cDNA模板進行病毒衣殼蛋白基因擴增；5 μL PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，采用紫外分光光度計檢測。endprint

2結果與分析

2.1藍莓外植體的誘導增殖

經CQWL+3.0 mg/L ZT培養基誘導1周，藍莓幼芽開始啟動（圖1-A）；經30 d繼代培養，藍莓幼芽誘導率為432%；經培養3代，藍莓出現叢生芽、頂芽生長，新梢健壯有活力（圖1-B），此時增殖系數約為3。

2.2莖尖剝離與增殖

顯微鏡下將頂芽剝為0.3～0.5 mm的莖尖，并插入誘導培養基中（圖2-A）誘導培養4周，藍莓莖尖不形成愈傷組織，而是直接發育成完整植株，新生頂芽長勢較快，形成3個莖段新梢，葉片墨綠（圖2-B）。

2.3藍莓莖尖RT-PCR快速檢測

試驗結果表明，以莖尖脫毒藍莓組培種苗的根和固體培養基為混合物提取的基因組DNA作為模板，不能擴增出16S rRNA，而大腸桿菌標準菌株基因組能擴增出16S rRNA，即莖尖繁殖不含致病的細菌（圖3-A）；以莖尖脫毒藍莓組培種苗的根和固體培養基為混合物提取的基因組DNA作為模板，不能擴增出rDNA- ITS序列，即莖尖繁殖不含致病的真菌（圖3-B）；莖尖脫毒苗中不含藍莓枯焦病毒和急性壞死病毒（圖3-C）。

2.4藍莓莖尖脫毒的增殖繁育

由圖4可見，莖尖脫毒材料經3代連續培養，植株健壯，葉片綠色，頂芽直立生長，側芽萌發伸長；植株發育正常，增殖系數可達5。

3結論與討論

目前，植物病毒及細菌的檢測方法主要有生物學、血清學、分子生物學及電鏡技術[12-13]。生物學檢測簡單、靈敏，僅需將少許宿主接種到指示植物即可，但缺點是受病毒滴度、環境、時間限制，病原確定的周期相對較長。以核酸為基礎的PCR檢測方法具有靈敏、特異、簡單、快速的特點，且在宿主發病早期即能檢測病原，已在馬鈴薯、甘薯、柑橘等病毒檢測[14-16]中廣泛應用。本研究利用PCR技術，對莖尖脫毒的藍莓種苗及培養基進行細菌16S rRNA檢測，結果表明，莖尖脫毒藍莓和培養基混合基因組不能擴增出16S rRNA，而大腸桿菌標準菌菌株基因組能擴增出16S rRNA，說明利用脫毒組培技術培養的莖尖種苗不含細菌。對真菌核糖體基因轉錄間隔區擴增結果為陰性，結果表明，莖尖脫毒藍莓不含真菌病原；參照RNA提取步驟，用Trizol試劑提取莖尖脫毒藍莓苗莖段的RNA，經RT-PCR檢測，結果表明，PCR產物電泳檢測無目的條帶，檢測結果為陰性，這說明莖尖脫毒藍莓有可能完全脫毒。因此，以此為依據建立的藍莓良種莖尖脫毒技術可用于藍莓的離體快繁。

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