番茄早疫病拮抗放線菌10—4菌株的發(fā)酵條件

何建清　張格杰　尹明遠

摘要：放線菌10-4菌株對番茄早疫病具有良好的拮抗效果，為進一步提高放線菌10-4菌株發(fā)酵液生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量，通過單因素和正交試驗研究發(fā)酵培養(yǎng)液、培養(yǎng)溫度、種齡、初始pH值、接種量等條件對10-4菌株抑制番茄早疫病病原菌效果的影響。結果表明，最佳發(fā)酵培養(yǎng)液配比為2.000 g可溶性淀粉、0.001 g FeSO4、0.050 g NaCl、0.050 g K2HPO4、0.050 g MgSO4、0.100 g KNO3、100 mL蒸餾水。10-4菌株發(fā)酵的優(yōu)化條件：溫度為28～34 ℃，種齡為 32 h，初始pH值為8，接種量為5%。正交試驗結果表明，發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A1B1C1，即發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時間為 72 h，裝液量為60 mL（裝液瓶為250 mL），此時10-4菌株生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的效果最好，生防放線菌10-4菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液可有效抑制番茄早疫病病原菌，抑制率高達96.2%。

關鍵詞：番茄早疫病；拮抗效果；放線菌10-4；發(fā)酵條件；優(yōu)化；抑菌活性；產(chǎn)量

中圖分類號： S436.412.1+4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0079-03

早疫病是番茄生產(chǎn)上重要的病害之一，由茄鏈格孢屬真菌（Alternaria solani）引起，該菌寄主范圍廣泛，除番茄外，還可感染辣椒、茄子、曼陀羅和馬鈴薯等[1]。該病常年造成番茄減產(chǎn)20%～30%，嚴重時可達 50%以上，甚至絕產(chǎn)[2]。目前生產(chǎn)上并無高抗或免疫的品種，因此運用抗病種質(zhì)防治該病并不現(xiàn)實[3]，而化學農(nóng)藥的長期過量使用，又會導致病原菌抗性增強，對環(huán)境污染加重，以及番茄果實有農(nóng)藥殘留等現(xiàn)象，因而，探尋新的防治番茄早疫病的方法和藥劑是目前生產(chǎn)上亟待解決的問題。利用微生物來防治植物真菌病害是當今植物真菌病害界十分熱門的研究領域之一。微生物防治是指通過生物間的相互作用，利用有益微生物或其代謝產(chǎn)物抑制致病微生物生長的生物防治手段[4]。微生物資源豐富、選擇性強、無殘留、無污染、成本低、兼防兼治、增產(chǎn)增收、保持生態(tài)平衡、起到長效的作用，所以具有廣闊的發(fā)展前景[5]。放線菌是最早被研究且應用到生產(chǎn)中的能產(chǎn)生大量抗生素的一種生防微生物，已有利用放線菌防治番茄早疫病害的報道[6]。菌株10-4是筆者所在課題組從西藏色季拉山亞高山草甸土壤中分離篩選出的1株對番茄早疫病菌有較強抑制作用的菌株，初步鑒定為腐生鏈霉菌[7]。為提高其產(chǎn)素水平，為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)提供依據(jù)，本研究采用生長速率法對不同培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下10-4 菌株發(fā)酵液的抑菌活性進行測定，旨在篩選適宜的培養(yǎng)基和優(yōu)化其適宜的發(fā)酵條件，以期為農(nóng)用活性物質(zhì)的開發(fā)和分離提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌菌株10-4，分離自西藏色季拉山亞高山草甸土壤中。

1.1.2指示菌番茄早疫病菌，由西藏大學農(nóng)牧學院真菌實驗室提供。

1.1.3培養(yǎng)基配方種子培養(yǎng)液：3 g蛋白胨，2.5 g葡萄糖，2 g CaCO3，1 000 mL 1%大豆餅粉浸汁，pH值為7.2。發(fā)酵培養(yǎng)液：選用12種發(fā)酵培養(yǎng)基（表1）[8-9]，各培養(yǎng)基 pH 值均為7.2，所有培養(yǎng)基均在 121 ℃、0.1 MPa 條件下滅菌 30 min 后備用。

1.2試驗方法

1.2.1初始發(fā)酵培養(yǎng)液基篩選將菌株10-4活化，用打孔器打成直徑為5 mm的菌塊，在250 mL三角瓶中接入50 mL種子培養(yǎng)液，再將菌塊放入三角瓶中，于 28 ℃、160 r/min 培養(yǎng) 4 d，獲得種子液。在250 mL 三角瓶中分別裝入50 mL 12種發(fā)酵培養(yǎng)基，按1% 的體積分數(shù)接入種子液，28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)4 d后，培養(yǎng)濾液10 000 r/min 離心 25 min，上清液用直徑為 0.45 μm 的無菌過濾膜過濾，將濾液與 PDA 培養(yǎng)基按體積比1 ∶[KG-*3]9制成平板，接入直徑為 5 mm 預先活化的指示菌塊，以不加發(fā)酵液的PDA 為對照培養(yǎng)基，設3次重復。28 ℃下培養(yǎng)4 d，測量菌落直徑，計算抑菌率，評價代謝物的活性。根據(jù)菌絲生長抑制率確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)液。菌絲生長抑制率= （對照菌落直徑-處理菌落直徑） /對照菌落直徑×100%。

1.2.2培養(yǎng)溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響在250 mL三角瓶中先接入50 mL“1.2.1”節(jié)中篩選出的發(fā)酵培養(yǎng)液，再接入1 %種子液，設24、26、28、30、32、34 ℃等6個溫度水平，160 r/min 振蕩培養(yǎng)4 d。按“1.2.1”節(jié)中的方法確定最佳的培養(yǎng)溫度。

1.2.3種子液種齡對發(fā)酵液抑菌活性的影響將“1.2.1”節(jié)中篩選出的培養(yǎng)基以1%的量分別接入種齡為24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 h的種子液，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，按“1.2.1”節(jié)中的方法確定最佳的接種菌齡。

1.2.4初始pH值對發(fā)酵液抑菌活性的影響將“1.2.1”節(jié)中篩選出的培養(yǎng)基用HCl、NaOH分別調(diào)節(jié)pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，高壓滅菌，接入1 %種子液，在28 ℃、160 r/min 條件下培養(yǎng)3 d，用生長速率法測定發(fā)酵液的抑菌作用。

1.2.5接種量對發(fā)酵液抑菌活性的影響將50 mL發(fā)酵液裝于250 mL的三角瓶中，將培養(yǎng)36 h的種子液以1%、3%、5%、7%、10%、15%、20%的量（體積分數(shù)）分別接入發(fā)酵瓶中，培養(yǎng)3 d并進行效價的生物測定。

1.2.6發(fā)酵條件的正交試驗在以上試驗結果的基礎上，選取發(fā)酵溫度、裝液量、發(fā)酵時間為主要發(fā)酵條件，設計3因素3水平的正交試驗，結果如表2所示。按不同的發(fā)酵條件發(fā)酵培養(yǎng)后，測定發(fā)酵液抑菌率的大小。

2結果與分析

2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

由圖1可知，10-4菌株在1號培養(yǎng)基中發(fā)酵的濾液不能抑制番茄早疫病病原菌的生長；在其余11種發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，菌株10-4均能產(chǎn)生抑制番茄早疫病病原菌的抗生素，其中9號培養(yǎng)基的抑菌率較高，達90.2%，因此，選擇9號培養(yǎng)基進行后續(xù)試驗。

2.2培養(yǎng)溫度對10-4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

在發(fā)酵過程中，菌體生長和產(chǎn)物的形成是在眾多酶的催化下進行的，適宜的溫度是保證酶活性的基本條件，也是使產(chǎn)物高產(chǎn)的保證。由圖2可知，溫度對10-4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響較大，28～34 ℃有利于10-4菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。

2.3種子液種齡對10-4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

將種子液按不同種齡以1%的量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)3 d，測定其抑菌率。由圖3可知，種子液種齡的最佳時間為32 h，此時菌體處于生命力旺盛的對數(shù)生長期。種齡太短，菌體量太少，會使發(fā)酵周期延長；種齡太長，菌體衰老，產(chǎn)素率降低，菌體較早自溶，影響抗生素的提取。

2.4初始pH值對10-4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

將9號培養(yǎng)基分別調(diào)節(jié)pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，高壓滅菌，按1%的量接10-4菌株的種子液于發(fā)酵瓶，在 28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)3 d，用生長速率法測定抑菌作用。由圖4可知，發(fā)酵液的初始pH值對10-4菌株發(fā)酵液的抑菌活性影響較大，pH值為8時，抑菌活性達到最高點，pH值低于6或高于9都不利于10-4菌株生產(chǎn)抗生素。說明弱堿性有利于產(chǎn)物活性的提高。

2.5接種量對10-4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖5可知，最適的種子液接種量為5%，此時10-4菌株發(fā)酵液的抑菌活性最高。

2.6發(fā)酵條件的正交試驗

在以上試驗結果的基礎上，選取發(fā)酵溫度、裝液量、發(fā)酵時間為主要發(fā)酵條件，設計3因素3水平的正交試驗，按不同的發(fā)酵條件發(fā)酵培養(yǎng)后測定抑菌率。 由表3可知，發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A1B1C1，即發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時間為 72 h，裝液量為60 mL，此時10-4菌株生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的效率最高，生防放線菌10-4菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液可有效抑制番茄早疫病病原菌，抑制率高達96.2%。對正交試驗的結果進行極差分析可知，各因素對10-4菌株生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響表現(xiàn)為發(fā)酵溫度>裝液量>發(fā)酵時間。

3結論

從不同培養(yǎng)基對10-4菌株發(fā)酵液的生物活性來看，10-4菌株的最佳初始發(fā)酵培養(yǎng)基為9號培養(yǎng)基，即2.000 g可溶性淀粉、0.001 g FeSO4 、0.050 g NaCl、0.050 g K2HPO4、0050 g MgSO4、0.100 g KNO3、蒸餾水100 mL。10-4菌株發(fā)酵液發(fā)酵過程的優(yōu)化條件：溫度為28～34 ℃，種齡為32 h，初始pH值為8，接種量為5%。正交試驗結果表明，發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A1B1C1，即發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時間為 72 h，裝液量為60 mL，此時10-4菌株生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的效率最高，生防放線菌10-4菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液可有效抑制番茄早疫病病原菌，抑制率高達96.2%。由正交試驗極差分析結果可知，各因素對 10-4菌株生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響表現(xiàn)為發(fā)酵溫度>裝液量>發(fā)酵時間。

發(fā)酵是抗生素產(chǎn)業(yè)化的基礎，這是因為盡管生防菌產(chǎn)抗生素的性能優(yōu)良，但若缺乏合理的發(fā)酵工藝，也不能將其潛力充分發(fā)揮。抗生素發(fā)酵除受營養(yǎng)因素的限制以外，合適的發(fā)酵條件也是不可忽視的重要因素。目前，就抗生素制備的農(nóng)藥數(shù)量、質(zhì)量和品種而言，還遠遠不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的需求。因此，如何提高抗生素發(fā)酵的產(chǎn)量已成為近年來相關學者研究的熱點[10]。為了提高放線菌10-4菌株的抑菌活性，本試驗通過單因素試驗和正交試驗方法，對其搖床發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行研究。結果表明，放線菌10-4菌株在初始pH值為8的9號培養(yǎng)液中，28 ℃下持續(xù)振蕩培養(yǎng)32 h，其抑菌物質(zhì)的活性最高。

此外，由于10-4菌株發(fā)酵液中活性物質(zhì)的成分是未知的，本試驗采用生物活性測定作為指示方法，但生物活性測定誤差較大，所以后續(xù)的研究中應在明確活性物質(zhì)的種類后，以活性物質(zhì)的量為指標，篩選出更佳的培養(yǎng)液配方和發(fā)酵工藝條件，以便進一步開發(fā)利用10-4菌株。

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