番茄早疫病拮抗放線菌10—4菌株的發酵條件

何建清　張格杰　尹明遠

摘要：放線菌10-4菌株對番茄早疫病具有良好的拮抗效果，為進一步提高放線菌10-4菌株發酵液生產抑菌活性物質的產量，通過單因素和正交試驗研究發酵培養液、培養溫度、種齡、初始pH值、接種量等條件對10-4菌株抑制番茄早疫病病原菌效果的影響。結果表明，最佳發酵培養液配比為2.000 g可溶性淀粉、0.001 g FeSO4、0.050 g NaCl、0.050 g K2HPO4、0.050 g MgSO4、0.100 g KNO3、100 mL蒸餾水。10-4菌株發酵的優化條件：溫度為28～34 ℃，種齡為 32 h，初始pH值為8，接種量為5%。正交試驗結果表明，發酵條件的最優組合為A1B1C1，即發酵溫度為28 ℃，發酵時間為 72 h，裝液量為60 mL（裝液瓶為250 mL），此時10-4菌株生產抑菌活性物質的效果最好，生防放線菌10-4菌株的發酵培養液可有效抑制番茄早疫病病原菌，抑制率高達96.2%。

關鍵詞：番茄早疫病；拮抗效果；放線菌10-4；發酵條件；優化；抑菌活性；產量

中圖分類號： S436.412.1+4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0079-03

早疫病是番茄生產上重要的病害之一，由茄鏈格孢屬真菌（Alternaria solani）引起，該菌寄主范圍廣泛，除番茄外，還可感染辣椒、茄子、曼陀羅和馬鈴薯等[1]。該病常年造成番茄減產20%～30%，嚴重時可達 50%以上，甚至絕產[2]。目前生產上并無高抗或免疫的品種，因此運用抗病種質防治該病并不現實[3]，而化學農藥的長期過量使用，又會導致病原菌抗性增強，對環境污染加重，以及番茄果實有農藥殘留等現象，因而，探尋新的防治番茄早疫病的方法和藥劑是目前生產上亟待解決的問題。利用微生物來防治植物真菌病害是當今植物真菌病害界十分熱門的研究領域之一。微生物防治是指通過生物間的相互作用，利用有益微生物或其代謝產物抑制致病微生物生長的生物防治手段[4]。微生物資源豐富、選擇性強、無殘留、無污染、成本低、兼防兼治、增產增收、保持生態平衡、起到長效的作用，所以具有廣闊的發展前景[5]。放線菌是最早被研究且應用到生產中的能產生大量抗生素的一種生防微生物，已有利用放線菌防治番茄早疫病害的報道[6]。菌株10-4是筆者所在課題組從西藏色季拉山亞高山草甸土壤中分離篩選出的1株對番茄早疫病菌有較強抑制作用的菌株，初步鑒定為腐生鏈霉菌[7]。為提高其產素水平，為工業發酵生產提供依據，本研究采用生長速率法對不同培養基和發酵條件下10-4 菌株發酵液的抑菌活性進行測定，旨在篩選適宜的培養基和優化其適宜的發酵條件，以期為農用活性物質的開發和分離提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌菌株10-4，分離自西藏色季拉山亞高山草甸土壤中。

1.1.2指示菌番茄早疫病菌，由西藏大學農牧學院真菌實驗室提供。

1.1.3培養基配方種子培養液：3 g蛋白胨，2.5 g葡萄糖，2 g CaCO3，1 000 mL 1%大豆餅粉浸汁，pH值為7.2。發酵培養液：選用12種發酵培養基（表1）[8-9]，各培養基 pH 值均為7.2，所有培養基均在 121 ℃、0.1 MPa 條件下滅菌 30 min 后備用。

1.2試驗方法

1.2.1初始發酵培養液基篩選將菌株10-4活化，用打孔器打成直徑為5 mm的菌塊，在250 mL三角瓶中接入50 mL種子培養液，再將菌塊放入三角瓶中，于 28 ℃、160 r/min 培養 4 d，獲得種子液。在250 mL 三角瓶中分別裝入50 mL 12種發酵培養基，按1% 的體積分數接入種子液，28 ℃、160 r/min 振蕩培養4 d后，培養濾液10 000 r/min 離心 25 min，上清液用直徑為 0.45 μm 的無菌過濾膜過濾，將濾液與 PDA 培養基按體積比1 ∶[KG-*3]9制成平板，接入直徑為 5 mm 預先活化的指示菌塊，以不加發酵液的PDA 為對照培養基，設3次重復。28 ℃下培養4 d，測量菌落直徑，計算抑菌率，評價代謝物的活性。根據菌絲生長抑制率確定最佳發酵培養液。菌絲生長抑制率= （對照菌落直徑-處理菌落直徑） /對照菌落直徑×100%。

1.2.2培養溫度對發酵液抑菌活性的影響在250 mL三角瓶中先接入50 mL“1.2.1”節中篩選出的發酵培養液，再接入1 %種子液，設24、26、28、30、32、34 ℃等6個溫度水平，160 r/min 振蕩培養4 d。按“1.2.1”節中的方法確定最佳的培養溫度。

1.2.3種子液種齡對發酵液抑菌活性的影響將“1.2.1”節中篩選出的培養基以1%的量分別接入種齡為24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 h的種子液，28 ℃、160 r/min振蕩培養3 d，按“1.2.1”節中的方法確定最佳的接種菌齡。

1.2.4初始pH值對發酵液抑菌活性的影響將“1.2.1”節中篩選出的培養基用HCl、NaOH分別調節pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，高壓滅菌，接入1 %種子液，在28 ℃、160 r/min 條件下培養3 d，用生長速率法測定發酵液的抑菌作用。

1.2.5接種量對發酵液抑菌活性的影響將50 mL發酵液裝于250 mL的三角瓶中，將培養36 h的種子液以1%、3%、5%、7%、10%、15%、20%的量（體積分數）分別接入發酵瓶中，培養3 d并進行效價的生物測定。

1.2.6發酵條件的正交試驗在以上試驗結果的基礎上，選取發酵溫度、裝液量、發酵時間為主要發酵條件，設計3因素3水平的正交試驗，結果如表2所示。按不同的發酵條件發酵培養后，測定發酵液抑菌率的大小。

2結果與分析

2.1發酵培養基的篩選

由圖1可知，10-4菌株在1號培養基中發酵的濾液不能抑制番茄早疫病病原菌的生長；在其余11種發酵培養基中發酵，菌株10-4均能產生抑制番茄早疫病病原菌的抗生素，其中9號培養基的抑菌率較高，達90.2%，因此，選擇9號培養基進行后續試驗。

2.2培養溫度對10-4菌株發酵液抑菌活性的影響

在發酵過程中，菌體生長和產物的形成是在眾多酶的催化下進行的，適宜的溫度是保證酶活性的基本條件，也是使產物高產的保證。由圖2可知，溫度對10-4菌株發酵液抑菌活性的影響較大，28～34 ℃有利于10-4菌株產生抑菌物質。

2.3種子液種齡對10-4菌株發酵液抑菌活性的影響

將種子液按不同種齡以1%的量接入搖瓶發酵培養基中，于28 ℃、160 r/min下振蕩培養3 d，測定其抑菌率。由圖3可知，種子液種齡的最佳時間為32 h，此時菌體處于生命力旺盛的對數生長期。種齡太短，菌體量太少，會使發酵周期延長；種齡太長，菌體衰老，產素率降低，菌體較早自溶，影響抗生素的提取。

2.4初始pH值對10-4菌株發酵液抑菌活性的影響

將9號培養基分別調節pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，高壓滅菌，按1%的量接10-4菌株的種子液于發酵瓶，在 28 ℃、160 r/min條件下培養3 d，用生長速率法測定抑菌作用。由圖4可知，發酵液的初始pH值對10-4菌株發酵液的抑菌活性影響較大，pH值為8時，抑菌活性達到最高點，pH值低于6或高于9都不利于10-4菌株生產抗生素。說明弱堿性有利于產物活性的提高。

2.5接種量對10-4菌株發酵液抑菌活性的影響

由圖5可知，最適的種子液接種量為5%，此時10-4菌株發酵液的抑菌活性最高。

2.6發酵條件的正交試驗

在以上試驗結果的基礎上，選取發酵溫度、裝液量、發酵時間為主要發酵條件，設計3因素3水平的正交試驗，按不同的發酵條件發酵培養后測定抑菌率。 由表3可知，發酵條件的最優組合為A1B1C1，即發酵溫度為28 ℃，發酵時間為 72 h，裝液量為60 mL，此時10-4菌株生產抑菌活性物質的效率最高，生防放線菌10-4菌株的發酵培養液可有效抑制番茄早疫病病原菌，抑制率高達96.2%。對正交試驗的結果進行極差分析可知，各因素對10-4菌株生產抑菌活性物質的影響表現為發酵溫度>裝液量>發酵時間。

3結論

從不同培養基對10-4菌株發酵液的生物活性來看，10-4菌株的最佳初始發酵培養基為9號培養基，即2.000 g可溶性淀粉、0.001 g FeSO4 、0.050 g NaCl、0.050 g K2HPO4、0050 g MgSO4、0.100 g KNO3、蒸餾水100 mL。10-4菌株發酵液發酵過程的優化條件：溫度為28～34 ℃，種齡為32 h，初始pH值為8，接種量為5%。正交試驗結果表明，發酵條件的最優組合為A1B1C1，即發酵溫度為28 ℃，發酵時間為 72 h，裝液量為60 mL，此時10-4菌株生產抑菌活性物質的效率最高，生防放線菌10-4菌株的發酵培養液可有效抑制番茄早疫病病原菌，抑制率高達96.2%。由正交試驗極差分析結果可知，各因素對 10-4菌株生產抑菌活性物質的影響表現為發酵溫度>裝液量>發酵時間。

發酵是抗生素產業化的基礎，這是因為盡管生防菌產抗生素的性能優良，但若缺乏合理的發酵工藝，也不能將其潛力充分發揮?？股匕l酵除受營養因素的限制以外，合適的發酵條件也是不可忽視的重要因素。目前，就抗生素制備的農藥數量、質量和品種而言，還遠遠不能滿足農業生產發展的需求。因此，如何提高抗生素發酵的產量已成為近年來相關學者研究的熱點[10]。為了提高放線菌10-4菌株的抑菌活性，本試驗通過單因素試驗和正交試驗方法，對其搖床發酵培養基及發酵條件進行研究。結果表明，放線菌10-4菌株在初始pH值為8的9號培養液中，28 ℃下持續振蕩培養32 h，其抑菌物質的活性最高。

此外，由于10-4菌株發酵液中活性物質的成分是未知的，本試驗采用生物活性測定作為指示方法，但生物活性測定誤差較大，所以后續的研究中應在明確活性物質的種類后，以活性物質的量為指標，篩選出更佳的培養液配方和發酵工藝條件，以便進一步開發利用10-4菌株。

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