霍山不同海拔香茶菜居群的遺傳多樣性

張曉舟　王祎玲

摘要：采用表型性狀和序列相關擴增多態(tài)性（簡稱SRAP）分子標記對香茶菜（Isodon japonica）不同海拔居群的遺傳多樣性進行分析。結果表明：（1）香茶菜8個葉表型性狀在居群間和居群內均存在顯著或極顯著差異，說明不同居群葉表型性狀存在明顯的變異；（2）香茶菜葉柄性狀的平均變異系數（CV，19.707%）>葉片性狀的平均變異系數（CV，9.905%），葉柄性狀穩(wěn)定性較低；（3）居群間平均表型分化系數（VST，69.89%）>居群內平均表型分化系數（VST，30.11%），居群間變異是其主要的變異來源；（4）非加權組平均法（簡稱UPGMA）聚類分析顯示，8個香茶菜居群分為三大類；（5）香茶菜居群具有較高的遺傳多樣性，平均多態(tài)位點數（NPL）、平均多態(tài)位點百分率（PPB）、平均Shannon多樣性指數（I）分別為60.875、82.083%、0.387；（6）8個居群遺傳多樣性變化規(guī)律隨海拔的升高先增加后降低；（7）分子生物學方差分析（簡稱AMOVA）顯示，居群間遺傳變異占總變異的75%，與表型性狀分析的主要變異來源一致；（8）聚類分析將8個居群分為3類，海拔相近的居群優(yōu)先聚類。

關鍵詞：香茶菜；表型性狀；SRAP；遺傳多樣性；霍山

中圖分類號： S567.03文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0107-05

霍山位于山西省南部，是傳說中太岳山的主要高峰，位于太行山中部，屬于臨汾盆地的邊緣區(qū)域[1]。由于受暖溫帶大陸性氣候和東南季風的影響嚴重，成為山西省乃至全國水熱條件相對較好的區(qū)域之一。

香茶菜（Isodon japonica）為唇形科（Labiatae）香茶菜屬（Isodon）植物，主要生長在非洲和亞洲，有150多種，在我國有90多種，山西、黑龍江、河南等20多個省內都比較常見[2]。香茶菜是中國藥材，它具有健胃、解毒、抗癌、增加免疫等功效，被用于治療咽喉腫痛、肝炎、癌癥、感冒發(fā)熱、腹部脹痛等[3]。從開始研究香茶菜至今，很多研究者從香茶菜的提取產物中提煉出有用的化合物，并深入地分析了其藥理作用，很多文獻報道以及臨床等實踐證明香茶菜在保護心肌正常工作等方面具有非常重要的作用，同時香茶菜在保健防護方面市場潛力非常大[4-5]。由此可見，香茶菜已成為中國最重要的草本之一。然而，香茶菜遺傳多樣性方面的研究卻很少，甚至沒有關于香茶菜表型的研究。

為確保我國合理發(fā)展和最大限度地使用遺傳資源，有必要研究香茶菜的遺傳多樣性。另外，香茶菜種質收集的遺傳多樣性和對群體結構的了解在改善中國草本植物上有非常重要的功能。近年來，分子標記技術日益發(fā)展，為野生植物遺傳多樣性研究提供了很多重要信息。在不同的分子標記中，SRAP分子標記對遺傳研究是最佳選擇，因為它在植物基因組中具有簡單、高效、高重復性、共顯性的特征。目前，關于香茶菜的研究主要集中在化合物組成、藥理效果上。本研究的目標是運用表型標記和SRAP分子標記闡述香茶菜的遺傳多樣性。

因此，在本研究中，使用10對香茶菜SRAP引物和8個表型性狀決定山西省霍山不同海拔香茶菜的遺傳多樣性。

1材料與方法

1.1植物材料采集

2015年6月外出采集，選取山西省霍山不同海拔的香茶菜為研究對象，從1 300 m至2 000 m每隔100 m設立1個種群，共設立8個居群。為避免試驗誤差，每個居群內至少采集15個個體的葉片，保存在放有硅膠的密封袋中，以便后續(xù)實驗室內的研究[6]。

1.2葉表型性狀分析

評價8個居群香茶菜的表型多樣性，每個居群選取采樣完整、保存最好的15個個體進行測量。在本試驗中測量8個表型性狀，分別是葉長（LL）、葉片長（LML）、葉片寬（LW）、葉片長/寬（LLW）、葉柄長（LSL）、葉柄基部寬（LFW）、葉柄長/寬（LSLW）、葉片長/葉柄長（LLL）。

1.3DNA提取物

采用改良的CTAB法[7]提取DNA，在提取過程中，利用β-巰基乙醇的還原性，有效地遏制DNA提取過程對細胞造成的褐化反應，大大降低了氧化損傷。抽提過程中，利用氯仿異戊醇除去蛋白質。加入-20 ℃無水乙醇，靜置一段時間，待沉淀析出，即得到DNA提取物。采用1%瓊脂糖電泳檢測DNA提取物中DNA的純度。

1.4SRAP分析與電泳

SRAP擴增在10 μL體系中進行，使用10 ng基因組DNA、1×PCR buffer、2.0 mmol/L MgCl2、10.0 mmol/L dNTPs、5 μmol/L引物、1.0 U Taq DNA聚合酶。所用引物由博仕生物公司提供。

PCR擴增項目的變性步驟為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共進行35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，保存于4 ℃。擴增片段被20倍的水稀釋，6 μL稀釋產物與4 μL Loading-buffer混合。擴增產物在1×TBE的6%變性甲叉雙丙烯酰胺凝膠中被檢測，1 500 V電泳120 min。通過使用銀染裝備使分離片段形象化。

1.5數據分析

1.5.1表型數據分析

上述8個表型性狀的巢式方差分析采用SPSS 17.0軟件完成[8]。種群間表型性狀的分化程度用表型分化系數（VST）表示[9]，表型分化系數=種群間方差分量/（種群間方差分量+種群內方差分量）。表型性狀的離散程度用變異系數（CV）表示，變異系數=標準差/平均值，即CV=S/X。采用NTSYSpc軟件的非加權組平均法（UPGMA）對表型性狀進行聚類分析。其他相關數據處理使用Excel 5.0等程序進行。

1.5.2遺傳數據分析

在篩選引物的過程中，選取穩(wěn)定性高、擴增條帶清晰、易于分辨的引物組合。對SRAP引物擴增出的片段進行“0，1”標記，將有帶處記為“1”，無帶處記為“0”。利用POPGENE 3.2版本軟件[10]，通過分析香茶菜的多態(tài)位點比率（PPB）、觀察等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon多樣性指數（I）、Neis基因多樣性指數（H），多態(tài)位點數（NPL）來證實香茶菜遺傳多樣性水平的遺傳參數[11]。應用MEGA4軟件[12]對香茶菜不同海拔的8個居群進行聚類分析。用GenALEx 6.4軟件[11]進行分子生物學方差（簡稱AMOVA）分析和各居群間的主坐標（簡稱PCoA）分析。

2結果與分析

2.1葉性狀表型多樣性

2.1.1香茶菜居群間和居群內表型性狀變異特征

山西省霍山8個不同海拔香茶菜的表型性狀測量結果（表2）顯示，葉柄長與葉柄基部寬均以2 000 m居群的均值最大（分別為50.47、3.66 mm）；1 300 m居群的均值最小（分別為29.61、2.95 mm）。葉長、葉片長、葉片寬均以1 400 m居群的平均值最大（分別為199.99、153.03、140.94 mm），葉片長、葉片長/寬均以1 600 m居群的平均值最小。隨著海拔的降低，基本呈現出葉片的性狀數值越大，葉柄性狀的數值越小。

本研究用變異系數的大小表示各性狀測量值離散程度的大小。變異系數越小，說明性狀的離散程度越小，表型多樣性的豐富程度越低；反之，說明性狀的離散程度越大，表型多樣性的豐富程度越高。由表3可知，香茶菜居群中各表型性狀的平均變異系數為16.207%，其中葉柄基部寬的平均變異系數最小（8.030%），葉片長/葉柄長的平均變異系數最大（30913%）。8個葉表型性狀的平均變異系數都較為穩(wěn)定，可應用于表型多樣性的相關研究中。

不同性狀在同一居群的變異系數也存在差異，1 600 m海拔的居群中葉片長/葉柄長最大（42.338%），葉片長/寬最小（10.449%），同一性狀在不同居群內的變異系數也存在不同，葉柄長/寬在1 300 m最小（16.959%），在 2 000 m 最大（46.338%）；葉片長/葉柄長在1 300 m最小（18.883%），在2 000 m最大（53.829%），表明不同海拔的環(huán)境差異引起葉表型性狀的差異。

香茶菜8個海拔居群的平均變異系數存在差異，由小到大排列為1 400 m（11.569%）<1 900 m（11.670%）<1 300 m（12.062%）<1 800 m（13.113%）<1 500 m（14272%）<1 700 m（18.453%）<1 600 m（21.429%）<2 000 m（27.089%），海拔1 400 m居群的葉表型分化程度最小，說明其表型多樣性也最低；海拔2 000 m居群的平均變異系數最大，分化程度最高，遺傳多樣性最豐富。

從對8個表型性狀的方差分析結果（表4）可以看出，山西省霍山香茶菜8個葉表型性狀在居群間存在極顯著差異，在居群內除葉柄基部寬存在顯著差異外，其余性狀均差異不顯著，說明同一居群內存在相對穩(wěn)定性。香茶菜平均表型分化系數為69.89%、居群間的平均方差分量為58.34%，居群內的平均方差分量為21.54%，表明葉表型性狀多樣性呈現出居群間大于居群內的特征，山西省霍山8個海拔葉表型性狀變異以居群間變異為主。山西省霍山香茶菜8個居群葉表

型性狀指數主要受居群間環(huán)境條件和海拔高度不同的影響較大。通過表4同時可以看出，葉片寬、葉片長/寬的表型分化系數較大，分別為85.23%、83.33%。說明這2個性狀的變異在居群間占優(yōu)勢。

2.1.2表型性狀聚類分析

根據歐式平均距離，對香茶菜8個海拔的8個葉表型性狀數據進行UPGMA聚類分析（圖1）。由圖1可知，在遺傳距離系數為0.05時出現分界線，8個居群被分為三大類。其中1 700、1 800 m海拔處的居群葉表型特征基本一致，聚為一類；1 900、2 000 m居群的葉表型性狀較為相似，聚為一類；1 300、1 400、1 500、1 600 m居群距離相近，聚為一類。整體上看，8個不同海拔居群葉表型性狀特征依海拔高度而聚類。

2.2葉的遺傳多樣性

2.2.1SRAP遺傳多樣性

8個海拔香茶菜居群的遺傳變異參數總結在表5中，NPL、PPB、Na、H、I值在海拔1 400 m居群有最大值（NPL=72.000、PPB=90.000%、Na=1.900±0302、H=0.333±0.168、I=0.492±0.224），在海拔1 800 m居群有最小值（NPL=46.000、PPB=57.500%、Na=1.575±0.498、H=0.224±0.208、I=0.329±0.299）。Ne值的最高值在海拔 1 300 m 居群（1.586±0.370），最低值在海拔 2 000 m 居群（1.385±0.371），平均值為1.444。

依據SRAP數據分析和比較香茶菜居群間和居群內的遺傳多樣性。AMOVA結果（表6）顯示，75%的遺傳多樣性來自居群間，25%的遺傳多樣性來自居群內，香茶菜的遺傳變異主要來自于居群間。AMOVA分析在居群間和居群內存在極顯著或顯著差異。

2.2.2居群的遺傳距離與聚類分析

利用POPGEN軟件進一步分析香茶菜居群間遺傳分化程度，結果（表7）表明，遺傳距離為0.037 5～0.221 2，遺傳的一致度為0.801 5～0.963 2。在海拔1 900、2 000 m的居群均與海拔1 300 m居群間有最大遺傳距離和最小遺傳相似度，該最大遺傳距離為0.221 2，最小遺傳相似度為0.801 5，呈現出較大的遺傳差異。

建立基于Nei遺傳距離的UPGMA聚類分析測量8個種基因觀察數；Ne為有效等位基因；H為Neis多樣性指數；I為Shannon多樣性指數。

3結論與討論

在植物適應進化的過程中，自然選擇作為推動力，引起了表型的分化，植物表型性狀的變異對促使植物適應當地生存環(huán)境具有重要意義[13]。表型性狀由基因與生態(tài)環(huán)境共同決定，而表型性狀的多樣性必然蘊含著基因組成的多樣性[14]。本研究通過對山西省霍山不同海拔香茶菜居群葉表型性狀的研究發(fā)現，8個葉表型性狀在居群間和居群內均存在極顯著或顯著差異。除了海拔1 300 m受人類活動影響較大外，在海拔1 400～2 000 m范圍內，葉長、葉片長、葉片寬這3個性狀的均值隨海拔的升高而遞減；葉柄長、葉柄基部寬的均值隨海拔的升高而增大。

香茶菜葉片8個表型性狀平均變異系數為16.207%，變異幅度為8.030%～30.913%，葉柄性狀的平均變異系數（19.707%）>葉片性狀的平均變異系數（9.905%），表明香茶菜居群內表型性狀離散程度較高，且葉片性狀是葉表型性狀中較為穩(wěn)定的遺傳特征。8個海拔中2 000 m香茶菜葉表型性狀變異系數均值最大，為27.089%，說明海拔2 000 m可能是山西省霍山香茶菜表型多樣性的中心。

香茶菜8個表型性狀的平均表型分化系數水平偏高（69.89%），高于苦楝（54.47%）[15]、白云杉（50.00%）[16]、紫丁香（43.93%）[17]、疏花薔薇（41.84%）[18]，說明該居群間存在較大的變異，反映了居群基因與環(huán)境間相互作用的復雜性，是不同環(huán)境選擇的結果，是種群分化的源泉[19-21]。香茶菜居群內平均表型分化系數偏低，為30.11%，說明香茶菜的主要變異來源是居群間的變異，該變異主要受到居群間環(huán)境差異的影響。

香茶菜8個居群依據葉表型性狀建立的系統(tǒng)發(fā)育樹在遺傳距離系數0.05處分為三大支。1 300～1 600 m聚為一支；1 700、1 800 m聚為一支；1 900、2 000 m聚為一支。結果表明，葉表型性狀的特征與地理距離特征相吻合。

不同海拔香茶菜8個居群的SRAP標記研究顯示（表6），在海拔1 400 m居群出現最大的多態(tài)位點數（72.000）、最高的多態(tài)位點百分比（90.000%）、最高的Shannon多樣性指數（0.492±0.224），具有較高的遺傳多樣性。隨著海拔降低到1 400 m，其遺傳變異水平有所下降（NPL=68.000、PPB=85.000%、I=0.481±0.246）；海拔升高到1 800 m，其遺傳變異水平進一步下降（NPL=46.000，PPB=57.500%，I=0.329±0.299）。由此可知，香茶菜遺傳變異水平的高低與海拔有關，整體表現為隨著海拔的升高，香茶菜遺傳多樣性呈現出先升高后降低的規(guī)律。野外調查發(fā)現，低海拔居群受到人為活動和牲畜啃食的影響較大，極易發(fā)生遺傳漂變，從而使其遺傳多樣性降低。當海拔繼續(xù)上升時，溫度隨之下降，影響香茶菜的生長發(fā)育，最終導致居群內個體數量減少，遺傳多樣性降低。

海拔分布與居群的遺傳關系之間有非常重要的意義。AMOVA分析顯示，香茶菜遺傳多樣性主要存在于居群間，因此居群間存在較高的基因流和遺傳分化（表7）。聚類分析中，海拔1 300 m單獨聚為一類，海拔1 400、1 500、1 600 m聚為一類，海拔1 700、1 800、1 900、2 000 m聚為一類，香茶菜居群間遺傳距離與地理距離之間有明顯的相關性。另外，統(tǒng)計學研究表明，影響居群水平上遺傳多樣性大小的因素是繁殖系統(tǒng)>分布范圍>生活方式>分類地位>種子傳播方式[22]。

8個海拔香茶菜葉表型性狀的多樣性和SRAP標記的遺傳多樣性均主要表現為居群間的遺傳變異，二者具有一致性。聚類分析中聚為三大類，均表現出海拔相近的居群優(yōu)先聚類，但各居群在每一大類中的聚集情況又有所不同。再次表明，表型的變異主要來源于基因組的變異，同時又受到生存環(huán)境的影響。

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