盤羊雜交羊SPLUNC1融合蛋白的真核表達

高寶德　張曉麗　劉海燕

摘要：為構建盤羊雜交羊SPLUNC1基因的真核表達載體并在巴斯德畢赤酵母中表達，從盤羊雜交羊口腔上顎的上皮細胞中提取總RNA，并反轉錄成cDNA，以該cDNA為模板采用逆轉錄PCR（RT-PCR）法克隆盤羊雜交羊SPLUNC1基因開放閱讀框，并克隆到pPIC9K載體中，構建真核表達載體pPIC9K-SPLUNC1，再將重組質粒電轉至畢赤酵母GS115中進行表達，表達產物經Ni-NTA瓊脂親和層析純化，并利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白質印跡（Western Blot）方法檢測。結果顯示，目的基因大小758 bp，重組表達質粒pPIC9K-SPLUNC1經雙酶切、PCR及測序鑒定構建成功；表達產物經SDS-PAGE分析，可見大小為25.96 ku的目的條帶，且在72 h表達量最大；純化后經SDS-PAGE和Western Blot分析，可見大小為25.96 ku的目的條帶。研究結果表明，利用真核表達系統在體外成功表達并純化了盤羊雜交羊rSPLUNC1蛋白，為深入研究盤羊雜交羊SPLUNC1蛋白的生物學功能奠定基礎。

關鍵詞：盤羊雜交羊；短顎、肺及鼻咽上皮細胞克隆1；融合蛋白；真核表達

中圖分類號： Q786文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0130-04

氣道上皮細胞構成宿主防御的第一道防線，上皮細胞分泌物有助于防止病原體侵害，協調免疫反應，并限制肺損傷。呼吸道分泌物含有大量蛋白質，這些蛋白很多是由上皮細胞分泌的，并在黏膜纖毛的清除、抗菌防御和免疫調節中有很重要的作用。其中短顎、肺及鼻咽上皮細胞克隆1（short palate，lung and nasal epithelium clone 1，簡稱SPLUNC1）基因就高效表達于口腔、鼻腔、鼻咽部及呼吸道黏膜[1]。

很多研究表明SPLUNC1是呼吸道黏膜分泌的具有抗菌活性的重要蛋白，體外的研究表明，重組人SPLUNC1被證實具有殺滅流感嗜血桿菌的抗菌活性[2]。Zhou等研究證明，使用不同濃度重組人SPLUNC1蛋白，可以減少銅綠假單胞菌的生長且具有劑量依賴性[3]。許多研究證實SPLUNC1在體內也具有較強的抗菌活性。Di研究證實，在被銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌感染時，過表達人SPLUNC1的轉基因小鼠比野生型小鼠抗菌活性明顯增強[4]。此外，過表達人SPLUNC1的轉基因小鼠與同窩出生的野生型小鼠相比對肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，簡稱Mp）感染的抵抗力顯著增強[5]。據報道，重組小鼠SPLUNC1蛋白可顯著抑制Mp的生長且具有劑量依賴性[6]。研究還表明，SPLUNC1具有結合革蘭氏陰性菌脂多糖的能力[7-8]。相關研究顯示，用逆轉錄PCR（RT-PCR）法檢測鼻咽癌活檢組織的SPLUNC1 mRNA表達水平，發現其比正常組織的表達量明顯下降，推測SPLUNC1可能是鼻咽癌的抑癌基因[9]。但目前對SPLUNC1功能的研究主要集中在人和鼠，還未見羊的有關該基因功能的相關報道。因此，本試驗通過構建盤羊雜交羊SPLUNC1基因真核表達載體，利用巴斯德畢赤酵母對SPLUNC1基因進行表達，使用Western Blot對目的蛋白檢測，為研究盤羊雜交羊SPLUNC1蛋白的生物學功能奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑

大腸桿菌DH5α由筆者所在實驗室保存；T4 DNA連接酶（天根生化科技有限公司）；反轉錄試劑盒、SnaBⅠ、NotⅠ、SacⅠ和Taq聚合酶，均購自TaKaRa公司；酵母氮堿（YNB）、G418、生物素，均購自索萊寶科技有限公司；蛋白Marker（Thermo）；酵母基因組DNA快速提取試劑盒、質粒小量提取制備試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA Marker DL2501和DNA Marker DL2503，購自上海捷瑞生物工程有限公司；Ni-NTA瓊脂（QIAGEN公司）；封閉液、一抗（Anti-His Antibody），購自天根生化科技（北京）有限公司；二抗辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（北京諾博萊德科技有限公司）；蛋白預染Marker（北京全式金生物技術有限公司）；GS115菌株及pPIC9K由新疆農墾科學院獸醫研究所薄新文研究員饋贈。

1.1.2試驗動物

盤羊雜交羊F1 5只，由石河子綠洲動物園提供。

1.2方法

1.2.1引物設計

根據筆者所在實驗室已克隆的盤羊雜交羊SPLUNC1基因cDNA全長序列，使用Primer5軟件設計1對特異性引物，并引入6×His標簽以及SnaBⅠ、NotⅠ酶切位點。上游引物SPL1：5′-TACGTAATGCACCACCACCACCACCACCTGCTAGAAGCCCTGCCCG-3′，下游引物SPL2：5′-GCGGCCGCTCAGACTTTGATGACAAATTCTAGCCC-3′。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2總RNA的提取及目的片段的擴增

用高壓滅菌的藥匙刮取盤羊雜交羊口腔上顎上皮細胞，置于1.5 mL離心管中，迅速加入1 mL TRIzol提取總RNA。用微量紫外檢測儀對RNA進行濃度測定，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。選用電泳條帶完整清晰且D260 nm/D280 nm值為1.9～2.0的RNA進行cDNA的合成。

用反轉錄試劑盒，以提取的總RNA為模板進行cDNA合成，以該cDNA為模板，用引物SPL1和SPL2進行PCR擴增，反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，65 ℃ 35 s，72 ℃ 60 s，34個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段膠回收后，-20 ℃保存備用。

1.2.3重組表達質粒pPIC9K-SPLUNC1的獲得

用SnaBⅠ和NotⅠ分別對盤羊雜交羊SPLUNC1基因擴增產物及pPIC9K載體進行雙酶切，用T4 DNA連接酶連接。用10 μL連接產物轉化100 μL感受態細胞DH5α，16 ℃過夜。轉化后涂布于含有100 mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂板，37 ℃過夜。挑取5個單菌落，接種于10 mL含有100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃、170 r/min振蕩過夜。取1 mL菌液，提取質粒，進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，同時將1mL菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。測序正確的重組質粒命名為pPIC9K-SPLUNC1。

1.2.4重組表達質粒pPIC9K-SPLUNC1的轉化與重組菌株鑒定

取80 μL感受態酵母菌GS115與20 μL SacⅠ線性化的重組表達質粒pPIC9K-SPLUNC1混合，電擊轉化后涂布于MD平板，28 ℃孵育約3 d，直至出現單菌落。

挑取5個單菌落，用酵母基因組快速提取試劑盒提取酵母基因組DNA，以其為模板，分別用特異性表達引物和載體上的通用引物（α-Factor：5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′）作基因型和表型鑒定。基因型鑒定的PCR反應條件同目的片段的擴增。表型鑒定的反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，34個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將表現型、基因型均鑒定正確的重組畢赤酵母依次接種至G418含量分別為0.25、050、1.00、2.00 mg/mL的YPD平板進行抗性篩選高拷貝，陽性菌株命名為GS115/pPIC9K-SPLUNC1。

1.2.5重組GS115/pPIC9K-SPLUNC1的誘導表達與產物的鑒定

將鑒定正確的重組GS115/pPIC9K-SPLUNC1接種于25 mL YPD液體培養基中，28 ℃恒溫培養至D600 nm約為4，8 000 r/min離心3 min，收集菌體。將菌體轉接于100 mL BMMY培養基中繼續培養。每24 h加入終濃度為0.5%的甲醇誘導表達，同時分別于0、24、48、72 h取1 mL菌液樣品，離心收集上清和菌體，并將上清和菌體分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定。

1.2.6表達產物的純化及Western Blot鑒定

將SDS-PAGE結果含目的條帶的表達產物用0.45 μm的濾膜過濾，濾液經Ni-NTA瓊脂親和層析柱，用10～15倍體積的結合緩沖液（pH值為8.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，含 0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）進行漂洗，直到吸光度達到穩定值，分管收集流出液體；用洗脫緩沖液（pH值為8.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液含0.5 mol/L NaCl，300 mmol/L咪唑）進行洗脫，分別收集流出液體并且經SDS-PAGE分析。

純化的蛋白經SDS-PAGE電泳后，將蛋白電轉到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，然后將膜置于封閉液中封閉1 h；一抗Anti-His標簽的鼠單克隆抗體（按1 ∶[KG-*3]2 000稀釋）4 ℃孵育過夜，過夜后用三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（TBS）+吐溫（T）（TBST）洗3次（10 min/次），二抗辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（按1 ∶[KG-*3]5 000稀釋）室溫孵育90 min，然后用TBST洗3次（10 min/次），最后用二氨基聯苯胺（DAB）顯色液進行顯色。

2結果與分析

2.1目的片段的擴增

以反轉錄獲得的cDNA為模板，用特異性表達引物進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，出現大小為758 bp的條帶，與預期片段大小相符合（圖1）。

2.2重組表達質粒pPIC9K-SPLUNC1的鑒定

用特異性表達引物對重組表達質粒pPIC9K-SPLUNC1進行PCR，鑒定出現大小為758 bp的1條帶，與試驗設計相符（圖2）。經SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切出現2條帶，1條大小約為10 kb，與載體片段大小相同；另1條大小為758 bp，與外源目的片段大小相同（圖3）。重組表達質粒pPIC9K-SPLUNC1的鑒定顯示，目的基因已克隆到pPIC9K載體中。

2.3重組菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1的PCR鑒定

以提取的重組酵母菌的基因組為模板，用特異性表達引物進行PCR，出現大小為758 bp的1條帶（圖4）。用載體上的通用引物進行PCR擴增，出現2條帶（圖5）。重組表達系統的PCR鑒定結果表明，重組表達酵母菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1轉化成功。

2.4SPLUNC1融合蛋白的鑒定

重組菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1經甲醇誘導表達后，培養上清經SDS-PAGE檢測，在25.96 ku出現1條目的條帶，與預測的目的蛋白大小相符，而在空載體表達產物和 0 h 未見有相同條帶（圖6），這表明重組SPLUNC1蛋白已表達成功。菌體經SDS-PAGE分析無預測的目的蛋白條帶。

2.5SPLUNC1融合蛋白的純化與鑒定

表達的蛋白經Ni-NTA瓊脂親和層析純化后，SDS-PAGE結果得到單一的大小為25.96 ku的融合蛋白目的條帶（圖7），純化后的融合蛋白經Western Blot分析，結果在 25.96 ku 處出現1條明顯的蛋白條帶（圖8），由此說明已在酵母中成功表達SPLUNC1融合蛋白并純化成功。

3討論

本試驗以盤羊雜交羊為研究對象，通過RT-PCR法擴增其SPLUNC1開放閱讀框，克隆到pPIC9K載體上，并電轉至GS115中用甲醇誘導表達，使用Ni-NTA瓊脂親和層析純化，SDS-PAGE檢測結果顯示成功獲得重組表達菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1和SPLUNC1融合蛋白。

近年來，通過將目的基因克隆到表達載體中，并將重組質粒導入真核表達系統中使其高效表達，是研究該基因功能及獲得重組蛋白的有效方法[10]。本試驗采用巴斯德畢赤酵母作為真核表達菌株。巴斯德畢赤酵母表達系統是外源蛋白表達過程中被廣泛使用的真核表達系統，也是目前外源蛋白表達系統中最方便、最有效的表達系統之一[11]。外源蛋白在巴斯德畢赤酵母中高效表達，有利于表達后蛋白純化、降低生產成本，在生產中具有重要意義[12]。巴斯德畢赤酵母能利用甲醇作為碳源，因為甲醇能夠誘導醇氧化酶（AOX）基因表達，產生AOX1，從而使其含量為總細胞蛋白含量的30%～40%[13]。本試驗的宿主菌為GS115菌株，該菌株具有完整的編碼AOX1基因，在含甲醇的培養基中能夠迅速生長，所以表型為Mut+（甲醇利用快速型），同時可以使外源蛋白得到高效表達。本試驗結果顯示，SPLUNC1融合蛋白在72 h表達量最大。

本研究所用的載體為pPIC9K載體，是一種分泌型載體。此載體以組氨醇脫氫酶基因（His4）為選擇標記，同時含有AOX1基因啟動子、終止子和卡那霉素抗性基因標記等。這樣的組合方式既有利于外源基因通過該質粒整合到酵母基因組中，也有利于重組酵母的篩選、表達以及外源蛋白的純化、檢測。本試驗結果顯示，甲醇誘導表達后SPLUNC1融合蛋白存在于重組酵母培養上清液中，而在菌體中無目的蛋白，這表明使用pPIC9K載體可使目的蛋白分泌到培養液中。與固定化金屬離子作用最強的氨基酸為組氨酸，多聚組氨酸標簽因其在表達過程中對目的蛋白性質影響較小以及純化方法簡單、方便、成本低等優點在蛋白質親和純化中被廣泛使用[14]。因此，本研究在設計引物時加入6×His標簽，所表達的蛋白含有His標簽，便于后續試驗中蛋白純化和檢測。本試驗結果顯示，所表達的His融合蛋白經Ni-NTA純化后雜蛋白減少，且能與抗His標簽抗體結合。

蛋白免疫印跡（Western Blot）結合了分辨率高的電泳技術以及高特異性和敏感性的酶免疫測定技術，是蛋白分析的一種常規技術，用于檢測樣品中是否存在特異蛋白[15]。本研究所表達的SPLUNC1融合蛋白含6×His標簽，因此本試驗使用His標簽抗體進行蛋白免疫印跡檢測表達產物中是否含有帶His標簽的SPLUNC1融合蛋白。結果顯示，出現1條特異性條帶，與預測相符，表明表達產物中存在SPLUNC1融合蛋白。

有資料報道，盤羊（[XZ（20#]♂[XZ）]）與巴什拜羊（♀）的雜交后代羔羊易感染綿羊肺炎支原體（mycoplasma ovipneumoniae，簡稱Mo）而引起大量死亡[16]。SPLUNC1基因是宿主先天性防御肺炎支原體感染的關鍵基因。本試驗利用畢赤酵母成功表達并純化了盤羊雜交羊SPLUNC1融合蛋白，為進一步研究盤羊雜交羊SPLUNC1基因的生物學功能奠定了基礎。

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