盤羊雜交羊SPLUNC1融合蛋白的真核表達

高寶德　張曉麗　劉海燕

摘要：為構(gòu)建盤羊雜交羊SPLUNC1基因的真核表達載體并在巴斯德畢赤酵母中表達，從盤羊雜交羊口腔上顎的上皮細(xì)胞中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法克隆盤羊雜交羊SPLUNC1基因開放閱讀框，并克隆到pPIC9K載體中，構(gòu)建真核表達載體pPIC9K-SPLUNC1，再將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115中進行表達，表達產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA瓊脂親和層析純化，并利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）方法檢測。結(jié)果顯示，目的基因大小758 bp，重組表達質(zhì)粒pPIC9K-SPLUNC1經(jīng)雙酶切、PCR及測序鑒定構(gòu)建成功；表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，可見大小為25.96 ku的目的條帶，且在72 h表達量最大；純化后經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析，可見大小為25.96 ku的目的條帶。研究結(jié)果表明，利用真核表達系統(tǒng)在體外成功表達并純化了盤羊雜交羊rSPLUNC1蛋白，為深入研究盤羊雜交羊SPLUNC1蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：盤羊雜交羊；短顎、肺及鼻咽上皮細(xì)胞克隆1；融合蛋白；真核表達

中圖分類號： Q786文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0130-04

氣道上皮細(xì)胞構(gòu)成宿主防御的第一道防線，上皮細(xì)胞分泌物有助于防止病原體侵害，協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)，并限制肺損傷。呼吸道分泌物含有大量蛋白質(zhì)，這些蛋白很多是由上皮細(xì)胞分泌的，并在黏膜纖毛的清除、抗菌防御和免疫調(diào)節(jié)中有很重要的作用。其中短顎、肺及鼻咽上皮細(xì)胞克隆1（short palate，lung and nasal epithelium clone 1，簡稱SPLUNC1）基因就高效表達于口腔、鼻腔、鼻咽部及呼吸道黏膜[1]。

很多研究表明SPLUNC1是呼吸道黏膜分泌的具有抗菌活性的重要蛋白，體外的研究表明，重組人SPLUNC1被證實具有殺滅流感嗜血桿菌的抗菌活性[2]。Zhou等研究證明，使用不同濃度重組人SPLUNC1蛋白，可以減少銅綠假單胞菌的生長且具有劑量依賴性[3]。許多研究證實SPLUNC1在體內(nèi)也具有較強的抗菌活性。Di研究證實，在被銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌感染時，過表達人SPLUNC1的轉(zhuǎn)基因小鼠比野生型小鼠抗菌活性明顯增強[4]。此外，過表達人SPLUNC1的轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩出生的野生型小鼠相比對肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，簡稱Mp）感染的抵抗力顯著增強[5]。據(jù)報道，重組小鼠SPLUNC1蛋白可顯著抑制Mp的生長且具有劑量依賴性[6]。研究還表明，SPLUNC1具有結(jié)合革蘭氏陰性菌脂多糖的能力[7-8]。相關(guān)研究顯示，用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法檢測鼻咽癌活檢組織的SPLUNC1 mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)其比正常組織的表達量明顯下降，推測SPLUNC1可能是鼻咽癌的抑癌基因[9]。但目前對SPLUNC1功能的研究主要集中在人和鼠，還未見羊的有關(guān)該基因功能的相關(guān)報道。因此，本試驗通過構(gòu)建盤羊雜交羊SPLUNC1基因真核表達載體，利用巴斯德畢赤酵母對SPLUNC1基因進行表達，使用Western Blot對目的蛋白檢測，為研究盤羊雜交羊SPLUNC1蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑

大腸桿菌DH5α由筆者所在實驗室保存；T4 DNA連接酶（天根生化科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SnaBⅠ、NotⅠ、SacⅠ和Taq聚合酶，均購自TaKaRa公司；酵母氮堿（YNB）、G418、生物素，均購自索萊寶科技有限公司；蛋白Marker（Thermo）；酵母基因組DNA快速提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取制備試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA Marker DL2501和DNA Marker DL2503，購自上海捷瑞生物工程有限公司；Ni-NTA瓊脂（QIAGEN公司）；封閉液、一抗（Anti-His Antibody），購自天根生化科技（北京）有限公司；二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（北京諾博萊德科技有限公司）；蛋白預(yù)染Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；GS115菌株及pPIC9K由新疆農(nóng)墾科學(xué)院獸醫(yī)研究所薄新文研究員饋贈。

1.1.2試驗動物

盤羊雜交羊F1 5只，由石河子綠洲動物園提供。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計

根據(jù)筆者所在實驗室已克隆的盤羊雜交羊SPLUNC1基因cDNA全長序列，使用Primer5軟件設(shè)計1對特異性引物，并引入6×His標(biāo)簽以及SnaBⅠ、NotⅠ酶切位點。上游引物SPL1：5′-TACGTAATGCACCACCACCACCACCACCTGCTAGAAGCCCTGCCCG-3′，下游引物SPL2：5′-GCGGCCGCTCAGACTTTGATGACAAATTCTAGCCC-3′。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2總RNA的提取及目的片段的擴增

用高壓滅菌的藥匙刮取盤羊雜交羊口腔上顎上皮細(xì)胞，置于1.5 mL離心管中，迅速加入1 mL TRIzol提取總RNA。用微量紫外檢測儀對RNA進行濃度測定，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。選用電泳條帶完整清晰且D260 nm/D280 nm值為1.9～2.0的RNA進行cDNA的合成。

用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以提取的總RNA為模板進行cDNA合成，以該cDNA為模板，用引物SPL1和SPL2進行PCR擴增，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，65 ℃ 35 s，72 ℃ 60 s，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段膠回收后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.3重組表達質(zhì)粒pPIC9K-SPLUNC1的獲得

用SnaBⅠ和NotⅠ分別對盤羊雜交羊SPLUNC1基因擴增產(chǎn)物及pPIC9K載體進行雙酶切，用T4 DNA連接酶連接。用10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μL感受態(tài)細(xì)胞DH5α，16 ℃過夜。轉(zhuǎn)化后涂布于含有100 mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂板，37 ℃過夜。挑取5個單菌落，接種于10 mL含有100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min振蕩過夜。取1 mL菌液，提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，同時將1mL菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-SPLUNC1。

1.2.4重組表達質(zhì)粒pPIC9K-SPLUNC1的轉(zhuǎn)化與重組菌株鑒定

取80 μL感受態(tài)酵母菌GS115與20 μL SacⅠ線性化的重組表達質(zhì)粒pPIC9K-SPLUNC1混合，電擊轉(zhuǎn)化后涂布于MD平板，28 ℃孵育約3 d，直至出現(xiàn)單菌落。

挑取5個單菌落，用酵母基因組快速提取試劑盒提取酵母基因組DNA，以其為模板，分別用特異性表達引物和載體上的通用引物（α-Factor：5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′）作基因型和表型鑒定。基因型鑒定的PCR反應(yīng)條件同目的片段的擴增。表型鑒定的反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將表現(xiàn)型、基因型均鑒定正確的重組畢赤酵母依次接種至G418含量分別為0.25、050、1.00、2.00 mg/mL的YPD平板進行抗性篩選高拷貝，陽性菌株命名為GS115/pPIC9K-SPLUNC1。

1.2.5重組GS115/pPIC9K-SPLUNC1的誘導(dǎo)表達與產(chǎn)物的鑒定

將鑒定正確的重組GS115/pPIC9K-SPLUNC1接種于25 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)至D600 nm約為4，8 000 r/min離心3 min，收集菌體。將菌體轉(zhuǎn)接于100 mL BMMY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。每24 h加入終濃度為0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達，同時分別于0、24、48、72 h取1 mL菌液樣品，離心收集上清和菌體，并將上清和菌體分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定。

1.2.6表達產(chǎn)物的純化及Western Blot鑒定

將SDS-PAGE結(jié)果含目的條帶的表達產(chǎn)物用0.45 μm的濾膜過濾，濾液經(jīng)Ni-NTA瓊脂親和層析柱，用10～15倍體積的結(jié)合緩沖液（pH值為8.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，含 0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）進行漂洗，直到吸光度達到穩(wěn)定值，分管收集流出液體；用洗脫緩沖液（pH值為8.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液含0.5 mol/L NaCl，300 mmol/L咪唑）進行洗脫，分別收集流出液體并且經(jīng)SDS-PAGE分析。

純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，然后將膜置于封閉液中封閉1 h；一抗Anti-His標(biāo)簽的鼠單克隆抗體（按1 ∶[KG-*3]2 000稀釋）4 ℃孵育過夜，過夜后用三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（TBS）+吐溫（T）（TBST）洗3次（10 min/次），二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（按1 ∶[KG-*3]5 000稀釋）室溫孵育90 min，然后用TBST洗3次（10 min/次），最后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液進行顯色。

2結(jié)果與分析

2.1目的片段的擴增

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，用特異性表達引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)大小為758 bp的條帶，與預(yù)期片段大小相符合（圖1）。

2.2重組表達質(zhì)粒pPIC9K-SPLUNC1的鑒定

用特異性表達引物對重組表達質(zhì)粒pPIC9K-SPLUNC1進行PCR，鑒定出現(xiàn)大小為758 bp的1條帶，與試驗設(shè)計相符（圖2）。經(jīng)SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切出現(xiàn)2條帶，1條大小約為10 kb，與載體片段大小相同；另1條大小為758 bp，與外源目的片段大小相同（圖3）。重組表達質(zhì)粒pPIC9K-SPLUNC1的鑒定顯示，目的基因已克隆到pPIC9K載體中。

2.3重組菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1的PCR鑒定

以提取的重組酵母菌的基因組為模板，用特異性表達引物進行PCR，出現(xiàn)大小為758 bp的1條帶（圖4）。用載體上的通用引物進行PCR擴增，出現(xiàn)2條帶（圖5）。重組表達系統(tǒng)的PCR鑒定結(jié)果表明，重組表達酵母菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1轉(zhuǎn)化成功。

2.4SPLUNC1融合蛋白的鑒定

重組菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達后，培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE檢測，在25.96 ku出現(xiàn)1條目的條帶，與預(yù)測的目的蛋白大小相符，而在空載體表達產(chǎn)物和 0 h 未見有相同條帶（圖6），這表明重組SPLUNC1蛋白已表達成功。菌體經(jīng)SDS-PAGE分析無預(yù)測的目的蛋白條帶。

2.5SPLUNC1融合蛋白的純化與鑒定

表達的蛋白經(jīng)Ni-NTA瓊脂親和層析純化后，SDS-PAGE結(jié)果得到單一的大小為25.96 ku的融合蛋白目的條帶（圖7），純化后的融合蛋白經(jīng)Western Blot分析，結(jié)果在 25.96 ku 處出現(xiàn)1條明顯的蛋白條帶（圖8），由此說明已在酵母中成功表達SPLUNC1融合蛋白并純化成功。

3討論

本試驗以盤羊雜交羊為研究對象，通過RT-PCR法擴增其SPLUNC1開放閱讀框，克隆到pPIC9K載體上，并電轉(zhuǎn)至GS115中用甲醇誘導(dǎo)表達，使用Ni-NTA瓊脂親和層析純化，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示成功獲得重組表達菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1和SPLUNC1融合蛋白。

近年來，通過將目的基因克隆到表達載體中，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入真核表達系統(tǒng)中使其高效表達，是研究該基因功能及獲得重組蛋白的有效方法[10]。本試驗采用巴斯德畢赤酵母作為真核表達菌株。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是外源蛋白表達過程中被廣泛使用的真核表達系統(tǒng)，也是目前外源蛋白表達系統(tǒng)中最方便、最有效的表達系統(tǒng)之一[11]。外源蛋白在巴斯德畢赤酵母中高效表達，有利于表達后蛋白純化、降低生產(chǎn)成本，在生產(chǎn)中具有重要意義[12]。巴斯德畢赤酵母能利用甲醇作為碳源，因為甲醇能夠誘導(dǎo)醇氧化酶（AOX）基因表達，產(chǎn)生AOX1，從而使其含量為總細(xì)胞蛋白含量的30%～40%[13]。本試驗的宿主菌為GS115菌株，該菌株具有完整的編碼AOX1基因，在含甲醇的培養(yǎng)基中能夠迅速生長，所以表型為Mut+（甲醇利用快速型），同時可以使外源蛋白得到高效表達。本試驗結(jié)果顯示，SPLUNC1融合蛋白在72 h表達量最大。

本研究所用的載體為pPIC9K載體，是一種分泌型載體。此載體以組氨醇脫氫酶基因（His4）為選擇標(biāo)記，同時含有AOX1基因啟動子、終止子和卡那霉素抗性基因標(biāo)記等。這樣的組合方式既有利于外源基因通過該質(zhì)粒整合到酵母基因組中，也有利于重組酵母的篩選、表達以及外源蛋白的純化、檢測。本試驗結(jié)果顯示，甲醇誘導(dǎo)表達后SPLUNC1融合蛋白存在于重組酵母培養(yǎng)上清液中，而在菌體中無目的蛋白，這表明使用pPIC9K載體可使目的蛋白分泌到培養(yǎng)液中。與固定化金屬離子作用最強的氨基酸為組氨酸，多聚組氨酸標(biāo)簽因其在表達過程中對目的蛋白性質(zhì)影響較小以及純化方法簡單、方便、成本低等優(yōu)點在蛋白質(zhì)親和純化中被廣泛使用[14]。因此，本研究在設(shè)計引物時加入6×His標(biāo)簽，所表達的蛋白含有His標(biāo)簽，便于后續(xù)試驗中蛋白純化和檢測。本試驗結(jié)果顯示，所表達的His融合蛋白經(jīng)Ni-NTA純化后雜蛋白減少，且能與抗His標(biāo)簽抗體結(jié)合。

蛋白免疫印跡（Western Blot）結(jié)合了分辨率高的電泳技術(shù)以及高特異性和敏感性的酶免疫測定技術(shù)，是蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)，用于檢測樣品中是否存在特異蛋白[15]。本研究所表達的SPLUNC1融合蛋白含6×His標(biāo)簽，因此本試驗使用His標(biāo)簽抗體進行蛋白免疫印跡檢測表達產(chǎn)物中是否含有帶His標(biāo)簽的SPLUNC1融合蛋白。結(jié)果顯示，出現(xiàn)1條特異性條帶，與預(yù)測相符，表明表達產(chǎn)物中存在SPLUNC1融合蛋白。

有資料報道，盤羊（[XZ（20#]♂[XZ）]）與巴什拜羊（♀）的雜交后代羔羊易感染綿羊肺炎支原體（mycoplasma ovipneumoniae，簡稱Mo）而引起大量死亡[16]。SPLUNC1基因是宿主先天性防御肺炎支原體感染的關(guān)鍵基因。本試驗利用畢赤酵母成功表達并純化了盤羊雜交羊SPLUNC1融合蛋白，為進一步研究盤羊雜交羊SPLUNC1基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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