基于SERS技術的茶葉中樂果農藥殘留的快速檢測

吳燕　彭芳　吳斌

摘要：基于表面增強拉曼光譜方法（surface-enhanced raman spectroscopy，簡稱SERS）與快速溶劑提取前處理技術，建立茶葉中樂果農藥殘留的快速檢測方法。以金納米粒子為增強基底，分別采集不同濃度樂果溶液的表面增強拉曼光譜和不同濃度以茶葉提取液為基質的樂果溶液表面增強拉曼光譜；采用無水硫酸鎂、四氯化三鐵、石墨化碳對提取液進行凈化處理，去除基質中葉綠素、礦物質、茶多酚、碳水化合物等物質的干擾；762、902、1 050、1 160、1 210、1 310、1 653 cm-1這7處譜峰可作為鑒定樂果農藥的峰。結果表明，茶葉中樂果農藥最低濃度能達到1.0 mg/L以下；對不同濃度以茶葉提取液為基質的樂果溶液表面增強拉曼光譜進行分析，發現762 cm-1處特征峰強度與樂果濃度在 1～10、8～25 mg/L內具有良好的線性關系；配制3個濃度樣本驗證方法的準確度，平均回收率為93.89%～96.36%，相對標準差為2.59%～4.87%，均小于5.00%，說明用該方法檢測茶葉中的樂果農藥具有較高的準確度和精密度。

關鍵詞：表面增強拉曼光譜；樂果農藥；茶葉；殘留；快速檢測

中圖分類號： TQ450.2+63文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0160-04

樂果是茶葉種植中使用最廣泛的農藥之一，對多種害蟲具有很高的毒效作用，殺蟲范圍廣。樂果農藥隨農產品進入人體后，藥效能達到1周左右，會抑制體內膽堿酯酶活性，造成神經生理功能紊亂，嚴重影響消費者的身心健康[1-2]。目前，農藥殘留常規檢測方法有氣相色譜法（GC）[3]、高效液相色譜法（HPLC）[4]等，這些方法具有準確、靈敏度高等特點，但前處理復雜、成本高、檢測速度慢、不適合現場實時快速檢測篩選。

表面增強拉曼光譜（surface-enhanced raman spectroscopy，簡稱SERS）技術能實現對微量樣品的快速檢測，具有樣品制備簡單、操作簡便、靈敏度高等優點，已逐步應用于食品和農產品中的農藥殘留快速檢測[5-7]。Li等利用表面增強拉曼光譜技術初步探討了蘋果中甲拌磷和倍硫磷的快速無損檢測方法[8]。Kim等以苯并咪唑類為研究對象，采集不同pH值下待測溶液的表面增強拉曼光譜，對拉曼譜峰進行歸屬[9]。張萍等采用快速溶劑提取前處理方法和表面增強拉曼光譜檢測技術建立豆芽中6-BA殘留物質的快速檢測方法[10]。Shende等采用固相萃取技術對橙汁進行前處理，結合表面增強拉曼光譜技術，檢測最低濃度為50 μg/L[11]。近年來，已有研究者將表面增強拉曼光譜技術用于茶葉的品質檢測[12-13]，但目前還未見利用拉曼光譜技術分析茶葉中樂果農藥殘留的相關報道。

本研究以商業化的金納米顆粒為基底，利用表面增強拉曼光譜技術對茶葉中樂果農藥殘留進行定性定量分析。以有機綠茶為研究載體，利用快速溶劑提取前處理的方法提取含農藥殘留茶葉的提取液，采用無水硫酸鎂、四氯化三鐵、石墨化碳對提取液進行凈化處理，去除基質中葉綠素、礦物質、茶多酚、碳水化合物等物質的干擾，建立茶葉中樂果農藥殘留的快速檢測方法，為茶葉生產過程中的農藥殘留檢測提供快速、準確、簡便的檢測方案。

1材料與方法

1.1原料

樂果標準品（99%，河北威遠生物化工股份有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，河北冠龍農化有限公司）；表面增強試劑（OTR202、OTR103，歐普圖斯光學納米科技有限公司）；硫酸鎂、四氯化三鐵、石墨化碳（河北冠龍農化有限公司）；有機綠茶；超純水。

1.2試驗儀器

高靈敏度激光拉曼光譜儀（RamTracer-200-HS，歐普圖斯光學納米科技有限公司）；渦旋混合器（VORTEX-5，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；恒溫數控超聲波清洗器（KQ-500GTDV，上海精密儀器有限公司）；精密天平（FA135S，精度為0.01 mg，上海精密儀器儀表有限公司）。

1.3樂果標準溶液的配制

準確稱取25 mg樂果標準品放入250 mL棕色容量瓶中，用適量甲醇超聲溶解，待完全溶解后定容至刻度，得到濃度為100 mg/L的樂果標準儲備液。用甲醇將標準儲備液稀釋成不同濃度的標準液待用：50.0、20.0、15.0、10.0、8.0、5.0、40、2.0、1.0、0.5 mg/L。

1.4以茶葉提取液為基質的樂果溶液配制

1.4.1空白茶葉提取液的提取準確稱取5 g茶葉樣品，放入離心管中，加入乙腈10 mL，渦旋1 min，再超聲提取2 min，以 4 200 r/min 轉速離心5 min，取上清液。

1.4.2以茶葉提取液為基質的樂果溶液配制取5 mL茶葉提取液和5 mL濃度為100 mg/L的樂果標準儲備液放入 15 mL 離心管中，渦旋、振蕩、混合均勻，得到50 mg/L以茶葉提取液為基質的樂果溶液。

1.4.3凈化將含有樂果農藥殘留的溶液加入裝有一定量的硫酸鎂、四氯化三鐵、石墨化碳的離心管中，混合振蕩 1 min，以4 200 r/min轉速離心5 min，去除基質中葉綠素、礦物質、茶多酚、碳水化合物等物質的干擾，取上清液用于拉曼光譜檢測。

以同樣方法，分別制備濃度為25.0、20.0、16.0、12.0、10.0、8.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.5 mg/L的以茶葉提取液為基質的樂果溶液。

1.5光譜數據采集

拉曼光譜采集參數：激發光源波長為785 nm，功率為 200 mW，光譜掃描范圍為400～1 800 cm-1，分辨率為 4 cm-1，積分時間為10 s，積分2次求平均值。向石英進樣瓶中加入500 μL濃度為50 mg/L的樂果溶液，放入樣品池中采集樂果標準溶液的普通拉曼光譜；向石英進樣瓶中加入以茶葉提取液為基質的500 μL濃度為50 mg/L的溶液，放入樣品池中，采集以茶葉提取液為基質的樂果溶液普通拉曼光譜；向石英進樣瓶中依次加入500 μL OTR202試劑、20 μL不同濃度的樂果溶液、100 μL OTR103試劑，混合均勻后放入樣品池中，采集待測溶液的表面增強拉曼信號；向石英進樣瓶中依次加入500 μL OTR202試劑、20 μL以茶葉提取液為基質的樂果溶液、100 μL OTR103試劑，混合均勻后放入樣品池中，采集待測溶液的表面增強拉曼光譜。所有數據分析基于激光拉曼光譜儀平臺完成。

2結果與分析

2.1樂果農藥的拉曼光譜分析

2.1.1樂果農藥的固體拉曼光譜和表面增強拉曼光譜比較

圖1-a是樂果的固體拉曼光譜，圖1-b是濃度為 20 mg/L 樂果標準溶液的表面增強拉曼光譜，光譜采集范圍為400～1 800 cm-1。樂果主要由C[FY=，1]N、C—N、C[FY=，1]O、CH2、C—O、CH3、P—S、N—H等基團組成。對比樂果的固體普通拉曼光譜和表面增強拉曼譜圖，樂果固體的2個最強峰494、646 cm-1在表面增強拉曼譜圖中沒有出現，而在表面增強拉曼譜圖中出現了一些新的拉曼峰：582、678 cm-1，表明樂果農藥分子在金膠的表面發生了較大的反應。在600～1 400 cm-1 范圍內，大多數拉曼峰變化為較小的波數：764～762、908～902、1 056～1 050、1 164～1 160、1 224～1 210、1 340～1 310 cm-1。

樂果固體和表面增強的拉曼峰及其歸屬如表1所示。762、902、1 050、1 160、1 210、1 310、1 653 cm-1這7處譜峰強度較高，對這7處特征峰進行譜峰歸屬[13]：最強峰出現在 762 cm-1 處，762 cm-1歸屬于P—O拉伸振動；902 cm-1歸屬于C—C伸縮振動，并伴有CH3的搖擺振動；1 050 cm-1歸屬于C—N伸縮振動和C—C伸縮振動；1 160、1 210 cm-1歸屬于CH2搖擺振動；1 310 cm-1歸屬于C—N伸縮振動，并伴有CH2的搖擺振動和N—H的彎曲振動；1 653 cm-1歸屬于C[FY=，1]O的伸縮振動，這些特征譜峰可作為鑒定樂果農藥的特征峰。

[FK（W12][TPWY1.tif]

2.1.2樂果農藥表面增強拉曼光譜和背景信號光譜的比較

圖2-a是濃度為10 mg/L樂果標準溶液的表面增強拉曼光譜，圖2-b是濃度為10 mg/L樂果標準溶液的普通拉曼光譜，圖1-c是金膠表面增強拉曼光譜，圖1-d是甲醇溶液表面增強拉曼光譜。對比樂果標準溶液的普通拉曼光譜和表面增強拉曼譜，普通拉曼光譜圖只有單一譜峰，且峰強不高，樂果溶液的普通拉曼光譜中沒有檢測到樂果的拉曼信號，而樂果溶液表面增強拉曼光譜中的譜峰較多，且譜峰強度較高，特征峰明顯， 說明納米增強試劑能有效增強樂果溶液的拉曼信號。對比甲醇溶液、金膠、樂果溶液的表面增強拉曼光譜可以發現，背景信號的表面增強拉曼光譜峰強較弱，且其譜峰位置與樂果農藥分子的譜峰不重合，說明樂果溶液的表面增強拉曼信號不會受到背景信號的干擾。762、902、1 050、1 160、1 210、1 310、1 653 cm-1這7處譜峰可作為鑒定樂果農藥的特征峰。

2.2樂果標準溶液的表面增強光譜

從圖3可以看出，隨著樂果標準溶液濃度的增加，其特征峰的強度不斷增強，1 050、1 160、1 210 cm-1變化最快，902、1 653 cm-1 其次，762、1 310 cm-1變化最慢，這可能是因為納米增強粒子與樂果農藥分子中各個基團表面吸附力的大小和方向不同導致的。隨著樂果標準溶液濃度的降低，拉曼特征峰的強度逐漸減弱，濃度為10.0 mg/L時，樂果的7處拉曼峰明顯，易識別；濃度為5.0、2.0、1.0 mg/L時，762、902、1 310 cm-1處拉曼信號明顯，而1 050、1 160、1 210 cm-1處拉曼信號沒有出現；濃度為0.5 mg/L時，762、902、1 310 cm-1處拉曼信號可以鑒別，但很微弱。由此表明，利用SERS技術檢測樂果標準溶液的濃度能達到0.5 mg/L以下。從圖3中可以看出，隨著樂果標準溶液濃度的降低，在762、1 310 cm-1處有良好的線性關系，可以用來對樂果農藥進行定量分析。

2.3茶葉中樂果農藥殘留分析

受茶葉中葉綠素、礦物質、茶多酚、碳水化合物等物質的干擾，樂果農藥分子的拉曼信號被削弱。本研究采用無水硫酸鎂、四氯化三鐵、石墨化碳對提取液進行凈化處理，去除基質中葉綠素、礦物質、茶多酚、碳水化合物等物質的干擾，凈化后含樂果農藥茶葉溶液的表面增強拉曼光譜如圖4所示。圖4-a、圖4-b、圖4-c中，762、902、1 310 cm-1處特征峰明顯，易識別；濃度為2.0 mg/L時，762、1 310 cm-1處的峰強度明顯降低，但依然能識別，902 cm-1處的拉曼特征峰已無法識別；濃度為1.0 mg/L時，762、1 310 cm-1處特征峰依然存在，峰強十分微弱，但依然能識別。因此，利用表面增強拉曼光譜技術檢測茶葉中樂果農藥的最低檢測濃度能夠達到 1.0 mg/L 以下。762 cm-1處特征峰明顯，沒有重疊峰的影響，選用該特征峰的強度制定標準曲線，發現特征峰 762 cm-1 處的峰強度與樂果濃度分別在1～10、8～25 mg/L時具有良好的線性關系。濃度范圍為1～10 mg/L時，線性方程為y=75.367x+1 657.5，r2=0.983 9（圖5-A）；濃度范圍為8～25 mg/L時，線性方程為y=36.389x+2 014.9，r2=0996 5（圖5-B）。

2.4準確度與精確度分析

為了驗證方法的準確度，采用在茶葉提取液中添加樂果農[CM（25]藥的方法，分別制備濃度為3、6、14 mg/L樂果溶液。對3個樣本采集表面增強拉曼光譜信號，用上述建立的方法對3個樣本進行預測，將添加值與預測值進行比較，結果見表2。本方法的預測結果與添加值基本一致，添加值與預測值的回收率為93.89%～96.36%，相對標準差為2.59%～4.87%，均小于5.00%，表明利用表面增強拉曼光譜法快速檢測茶葉中樂果農藥殘留是可行的。

3結論與討論

研究采用快速前處理和表面增強拉曼光譜技術檢測干茶葉中樂果農藥殘留，建立干茶葉中樂果農藥殘留的快速檢測分析方法，確定樂果農藥的7個拉曼特征峰：762、902、1 050、

1 160、1 210、1 310、1 653 cm-1。該方法檢測茶葉中樂果農藥的最低濃度能達到1.0 mg/L以下。以762 cm-1處的拉曼峰強度建立茶葉中樂果農藥殘留檢測的標準曲線，低濃度范圍（1～10 mg/L）的線性方程為y=75.367x+1 657.5，r2=0.983 9，高濃度范圍（8～25 mg/L）的線性方程為y=36.389x+2 014.9，r2=0.996 5。用3個樣本對方法的準確性進行驗證，結果顯示，本方法的預測結果與添加值基本一致，回收率為93.89%～ 96.36%，相對標準差為2.59%～487%，均小于5.00%，說明采用該方法檢測茶葉中的樂果農藥殘留是準確可靠的。該方法前處理簡單，耗時短，整個過程在 15 min 內完成，為茶葉大規模生產的農藥殘留快速檢測方案的建立提供了技術支持。

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