施肥方式對黃瓜連作土壤微生物區系及多樣性的動態影響

張洋　李青　梅麗娟

摘要：利用稀釋平板計數和PCR-變性梯度凝膠電泳（簡稱PCR-DGGE）等方法，分析化肥（FT）、普通有機肥+化肥（FC）、微生物有機肥+化肥（FB）、不施肥（CK）等不同基肥處理條件下，連作1、3、5、7茬黃瓜土壤細菌、放線菌、真菌數量及多樣性的動態變化。結果表明：（1）隨著連作茬數的增加，根際土壤微生物數量呈逐漸增加趨勢；（2）與對照相比，施用化肥處理總體上明顯促進了連作土壤中放線菌、真菌數量的增加，而對細菌數量的增加有明顯的抑制作用，施用普通有機肥+化肥對細菌、放線菌數量的增加均有不同程度的促進作用；（3）連作及不同施肥方式對土壤細菌群落結構均能產生不同程度的影響，除對照處理外，其他施肥處理土壤細菌多樣性及豐富度隨著連作茬數的增加呈下降趨勢，相對于化肥及普通有機肥+化肥處理，微生物有機肥+化肥處理對維持連作過程細菌多樣性及豐富度具有明顯作用；（4）連作均促進了FT、FB、FC等3種施肥處理根際土壤真菌多樣性及豐富度的上升，但與對照相比上升幅度較小，在連作7茬后土壤真菌多樣性及豐富度表現為FB>FC>FT。

關鍵詞：施肥方式；黃瓜連作；細菌；真菌；多樣性；PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0231-05

隨著我國現代農業的不斷發展，設施栽培面積逐年增加并呈規?；厔?。在市場經濟驅動下的商品化設施蔬菜生產中，連作障礙普遍發生。黃瓜作為設施蔬菜的主要品種之一，近年來其連作障礙的發生機制及防治受到學者們的廣泛關注。已有研究表明，自毒作用、土壤理化性質劣化、土壤微生物區系失衡是黃瓜連作障礙發生的主要原因[1-2]，并且認為土壤滅菌[3]、嫁接[4]、合理輪作[5]、施用有機肥及微生物肥料[6-7]等措施可有效防止黃瓜連作障礙的發生。其中施用有機肥在平衡礦質營養、提高作物品質和產量的同時，可提高土壤微生物活性，有利于土壤健康微生物區系的形成[8-10]。作為一種方便、低成本的農藝措施，合理施用有機肥對黃瓜連作障礙的預防與控制具有重要的實踐意義。目前有關施肥方式對黃瓜連作土壤微生物區系影響的研究較少，關于不同施肥方式對黃瓜連作過程土壤微生物區系及多樣性動態變化的研究更是鮮有報道[10-12]。本研究基于無機肥（化肥）、有機肥、微生物有機肥，設置不同的施肥處理，跟蹤分析不同施肥條件下大棚黃瓜連作過程中土壤微生物區系及多樣性的動態變化，以期為黃瓜連作土壤微生物區系的維持及連作障礙的預防及緩解提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗設計

試驗于2011年7月至2015年5月在江蘇省揚州市農作物品種區域試驗站大棚內進行。試驗所用土壤為沙質壤土，已經連續4年種植黃瓜，每年種植2茬，共連作7茬。試驗共設4個處理，每個處理3次重復，每個處理小區面積為27 m2，小區間隔 25 cm，并采用南北向條壟方式種植，每季收獲后將壟拉平、施肥后再起壟，并逐茬沿用。在盛果期每個小區追施1次2.024 kg的復合肥，具體處理和代號見表1。

1.2試驗材料

化肥（復合肥，即無機肥）為市售，其中N ∶[KG-*3]P2O5 ∶[KG-*3]K2O 為15 ∶[KG-*3]13 ∶[KG-*3]12；普通有機肥為發酵雞糞；微生物有機肥由南京農業大學提供。供試土壤基本理化性質：總氮含量1.81 g/kg，總磷含量 0.87 g/kg，速效磷含量43.66 m g/kg，速效鉀含量 155.81 mg/kg，有機質含量26.96 g/kg，總鹽含量5.67 g/kg，電導率為806.50 μS/cm，pH值為7.80。

1.3土壤樣品采集與處理

于每茬黃瓜成熟期對不同處理及各重復小區采用5點法采集黃瓜根際土壤樣品，采用4分法混勻后置于4、 -80 ℃ 冰箱中保存。

1.4土樣微生物數量測定

采用稀釋平板法[13]。分別用牛肉膏蛋白胨培養基、馬丁氏孟加拉紅培養基、高氏1號培養基對土壤細菌、霉菌、放線菌數量進行測定。微生物數量以1 g干土中的菌落數表示。

1.5土壤總DNA的提取

采用試劑盒（FastDNA SPIN Kit，MP Biomedicals，美國）提取各土壤樣品微生物總DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20 ℃保存。

1.6土樣DNA的PCR擴增

分別采用細菌16S通用引物P2/P3+GC[14]和真菌28S通用引物U1/U2+GC[15]對土壤微生物總DNA進行PCR擴增，引物具體信息如表2所示。細菌PCR擴增反應程序為 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 10 min。真菌PCR擴增反應程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 10 min。

細菌、真菌PCR擴增體系為Taq DNA聚合酶（大連TaKaRa公司）0.25 U，10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/反應，大連TaKaRa公司）4 μL，引物各1 μL（20 μmol/L），牛血清白蛋白（BSA） 5 μL（10 mg/mL），模板DNA 2 μL，無菌水補足至50 μL。

擴增產物均經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，于4 ℃冰箱中保存。

1.7PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）

采用Bio-Rad公司的DcodeTM基因突變檢測系統對PCR產物進行電泳分離。細菌及真菌電泳條件均為8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為20%～60%，電泳緩沖液為1×TAE，130 V 電壓，60 ℃電泳720 min。電泳結束后用EB染色 30 min，無菌水褪染10 min，最后用Bio-Rad凝膠成像分析系統觀察結果并拍照。

1.8數據處理

采用Quantity One 4.6（Bio-Rad）軟件對PCR-DGGE圖譜進行分析，電泳條帶的數量代表細菌和真菌的群落豐富度（S）；通過DGGE圖譜的數字化結果分別計算土壤樣品中細菌和真菌群落的多樣性指數（H），Shannon-Weaver多樣性指數

式中ni為每個峰的面積，N為所有峰的面積和，s為條帶數。對樣品采用不加權平均連鎖聚類（UPGMA） 的處理方法進行簇群歸類。

2結果與分析

2.1不同施肥處理對黃瓜連作土壤微生物區系的影響

土壤細菌、放線菌、真菌是土壤微生物的主要組成部分，其數量是衡量土壤中微生物區系健康狀況的1個重要指標。由圖1-a可知，隨著連作茬數的增加，各施肥處理根際土壤細菌數量均呈增加趨勢；微生物有機肥+化肥處理（FB）根際土壤細菌數量除連作第5茬外其他茬均顯著高于其他處理；化肥處理（FT）細菌數在黃瓜連作各階段均低于對照，且從連作第3茬開始差異達顯著水平。上述結果說明，隨著連作茬數的增加，各肥料處理根際土壤細菌數量均持續增加，但相對于同茬對照處理，化肥處理對細菌數量有明顯的抑制作用，而有機肥+化肥處理（FC、FB）尤其是微生物有機肥+化肥處理（FB）對細菌增加有明顯的促進作用。

由圖1-b可知，隨著連作茬數的增加，各施肥處理根際土壤放線菌數量均呈增加趨勢；與CK處理相比，FT處理的放線菌數量除連作第3茬外其他茬均顯著高于CK處理； FB處理的放線菌數量除連作第3茬外均顯著高于CK處理，且隨連作茬數的增加，其增幅逐漸明顯高于FT處理；FC處理除連作第1茬外根際土壤放線菌數量均高于其他處理。上述結果表明，隨著連作茬數的增加，各肥料處理根際土壤放線菌數量均持續增加，與對照相比，化肥、普通有機肥+化肥、微生物肥料+化肥處理對放線菌數量增加均有不同程度的促進作用，其中，普通生物有機肥+化肥的促進作用在各茬次均比較明顯。

由圖1-c可知，隨著連作茬數的增加，各施肥處理根際土壤真菌數量均呈增加趨勢；相對于CK處理，各連作茬次FT處理除連作第3茬外其他茬土壤真菌數量均明顯提高，而FC、FB處理真菌數量在不同茬次表現為高低交替狀態，其中FC處理根際土壤真菌數量均除連作第1茬外顯著高于其他處理。上述結果表明，隨著連作茬數的增加，各肥料處理根際土壤真菌數量均持續增加。

2.2不同施肥處理對黃瓜連作土壤細菌群落結構及多樣性的影響

依據不同施肥處理連作第 1、7茬土壤細菌PCR-DGGE指紋圖譜（圖2-a），進行群落結構聚類分析（圖2-b）。結果顯示，相對于CK，不同施肥處理對同茬土壤細菌群落結構的影響存在差異，連作前期表現為FB>FC>FT，連作7茬后表現為FB>FT>FC；除FB處理外，連作過程各施肥處理土壤細菌群落結構均發生變化；FB處理對連作前期土壤細菌群落結構有較大影響，并且在連作7茬后未發生明顯變化。

進一步對上述處理土壤細菌遺傳多樣性指數進行計算。表3表明，與CK相比，有機、無機肥處理均能在短期內促進根際土壤細菌多樣性及豐富度的提高，并且這種作用在不同肥料處理間存在差異；連作7茬后不同肥料處理土壤細菌多樣性及豐富度均有不同程度下降甚至低于同期CK處理，FB處理下降程度相對小于FT及FC處理。

上述結果說明，連作導致土壤細菌群落結構發生明顯變化，各施肥處理對連作不同時期土壤細菌群落結構產生不同程度的影響；從細菌多樣性及豐富度上看，連作后對照處理呈增加趨勢，而其他施肥處理均呈相反趨勢，且連作7茬后土壤細菌多樣性及豐富度呈現FB>FT>FC。

2.3不同施肥處理對黃瓜連作土壤中真菌群落結構及多樣性的影響

依據不同施肥處理第1、7茬土壤真菌PCR-DGGE指紋圖譜（圖3-a），進行群落結構聚類分析（圖3-b）。結果顯示，相對于CK處理，不同施肥處理對同茬土壤真菌群落結構的影響存在差異，連作前期FT、FB處理對真菌群落結構的影響比FC處理更大，連作7茬后表現為FB>FT>FC；連作導致各施肥處理土壤真菌群落結構均發生變化；FT、FB處理對連作前期土壤真菌群落結構有較大的影響，但在連作7茬后對真菌群落結構的影響變?。▓D3）。

進一步對上述處理土壤真菌遺傳多樣性指數進行計算。結果表明，與CK處理相比，FC、FB處理均能在短期內促進根際土壤真菌多樣性及豐富度的提高，而FT處理降低了根際土壤真菌的多樣性及豐富度；連作7茬后不同肥料處理土壤真菌多樣性及豐富度均有不同程度上升，但是均不高于同茬CK處理，FC處理上升程度相對小于FT及FB處理（表4）。

上述結果說明，連作導致土壤真菌群落結構發生明顯變化，各施肥處理對連作不同時期土壤真菌群落結構有不同程度的影響?？傮w上，連作促進了施肥處理根際土壤真菌多樣性及豐富度的上升，但與對照相比上升幅度較小；在連作7茬后土壤真菌多樣性及豐富度表現為FB>FC>FT。

3結論與討論

周寶利等認為，隨著連作年限的增加，根際土壤中細菌和放線菌數量急劇下降，真菌數量顯著上升[16-17]。馬云華等研究發現，連作黃瓜土壤細菌和放線菌數量在5年前明顯上升，5年后急劇下降，呈倒馬鞍形變化[2]；真菌數量隨連作年限的增加而增長，趙萌等的研究也有相似結果[18]。本試驗結果表明，連作4年的黃瓜根際土壤中細菌、放線菌、真菌的數量均呈增加趨勢。這與馬云華等的研究結果[2，18]一致，而與周寶利等的研究結果[16-17]并不完全一致，其原因可能是由于種植作物種類不同、土壤基本性狀不同[19]。與對照相比，單施復合肥使根際土壤真菌、放線菌的數量呈增加的趨勢，而細菌的數量呈下降趨勢；有機-無機肥的配施使根際土壤細菌、放線菌的數量總體呈增加趨勢，而真菌的數量多數呈下降趨勢，與單施化肥相比下降更明顯。這與其他學者的研究結果[20]相似，說明相比化肥的單施，有機-無機肥的配施可以有效地降低黃瓜連作土壤中真菌與細菌比率，為作物提供更加良好的生長環境[21]。

土壤微生物群落結構的研究結果表明，不施基肥條件下（CK），連作增加了細菌及真菌的多樣性，馬寧寧等通過 PCR-DGGE技術對設施番茄連作土壤微生物群落結構及多樣性的研究也證實了這一結果[21]；而吳鳳芝等通過隨機擴增多態性DNA（RAPD）技術研究設施黃瓜連作對微生物群落多樣性的影響時發現，隨著連作年限的增加，土壤細菌和真菌多樣性及豐富度處于下降趨勢[22]。本試驗條件下得到的結果與吳鳳芝等的結果[22]不一致，可能與以上2種分子生物學技術有關，當然土壤質地、肥力以及施肥等均會影響結果，有關方面還需進一步研究。

夏昕等認為，與對照相比，在紅壤性水稻土壤中長期施用化肥降低了土壤細菌多樣性，而長期施用無機-有機豬糞肥增加了細菌的多樣性[23]。夏昕等對長期施肥條件下菜田土壤真菌多樣性研究表明，與對照相比，無機-有機馬糞肥的配施增加了真菌的多樣性，而無機肥單施降低了真菌的多樣性[24]。魏巍等在研究長期施肥對黑土農田土壤微生物群落的影響時發現，長期施用化肥降低了細菌和真菌的多樣性，化肥配施有機豬糞肥降低了細菌多樣性，卻增加了真菌的多樣性[25]。因為土壤類型是影響細菌的最主要因素，而土壤管理與施肥是影響真菌的最主要因素，上述試驗的供試土壤基礎養分對比顯示，魏巍等試驗用的土壤為典型黑土，有機質含量明顯高于其他2種土壤，所以結果的差異可能與供試土壤的養分狀況有關[25-26]。而本試驗結果顯示，連作條件下各施肥處理的土壤細菌與真菌多樣性均低于CK處理，但無機肥配施微生物有機肥條件下土壤細菌和真菌的多樣性與CK處理并沒有顯著差異。本試驗供試土壤基礎養分狀況與魏巍等的試驗土壤最為接近，所以細菌多樣性與魏巍等的研究結果趨于相似，而施肥種類的不同可能導致了兩者在真菌變化趨勢上的差異[25]。

通過比較不同施肥處理對黃瓜連作土壤微生物區系以及細菌和真菌群落結構的影響可以看出，較其他施肥處理而言，微生物有機肥的連續施用能夠使連作土壤中細菌多樣性更為豐富，群落物種分布更為均勻，群落結構更為穩定；而對于真菌，無機-有機肥配施的2種處理都能夠較好地穩定真菌的群落結構，但是化肥-微生物有機肥配施較化肥-普通有機肥配施能更好地提高土壤中真菌的多樣性及豐富度。土壤微生物結構越穩定，多樣性越豐富，物種分布越均勻，對病原菌拮抗能力就越強[27]。

綜上所述，微生物有機肥與化肥（復合肥）的配施更有利于根際健康土壤細菌、真菌群落結構的構建。PCR-DGGE技術雖然具有重現性強、可靠性高、速度快等優點，但是它只能對微生物群落中數量大于1%的優勢種群進行分析[28]，而且不同的DGGE試驗條件也可能導致出現不同的指紋圖譜，這對系統發育分析均有一定的影響。因此，仍需進一步應用高通量測序技術，更全面、詳細地了解不同施肥處理對連作土壤中細菌、真菌的多樣性及豐富度的影響。

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